Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化復(fù)合奶酒發(fā)酵工藝

江宇琪，王琪，劉琨毅，趙金松，吳冬梅

(1.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院五糧液技術(shù)學(xué)院，四川宜賓644003；2.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000；3.瀘州職業(yè)技術(shù)學(xué)院白酒學(xué)院，四川瀘州646005)

0 引 言

目前，市面上大部分的乳酒都是以馬奶或羊奶為原料，以開菲爾粒或酵母菌與乳酸菌的混合菌為發(fā)酵劑，但存在酸度普遍偏高的不良特性[1-8]。利用大豆制得的豆?jié){與馬奶或羊奶相比，含有較為豐富的植物蛋白質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是馬奶或羊奶理想的替代品，也是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[9-11]。豆?jié){酒作為一種含有酒精的復(fù)合飲料，與傳統(tǒng)的乳酒相比，其特點(diǎn)是含有豐富的植物蛋白和豆乳的其他營(yíng)養(yǎng)成分，既補(bǔ)充了我國(guó)居民因牛乳等動(dòng)物蛋白攝入不足的缺陷，又比傳統(tǒng)的乳酒口感更加柔和[12-14]。雖然豆?jié){酒酒體風(fēng)味獨(dú)特、口感柔和，但是其香味不夠豐滿濃郁進(jìn)而影響豆?jié){酒整體的感官特性[14－15]。

復(fù)合型發(fā)酵酒是使用兩種或兩種以上的釀酒原料發(fā)酵而成的酒品，其能綜合兩種或兩種以上原料的特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)，彌補(bǔ)利用單一原料釀酒在色、香、味上的欠缺和營(yíng)養(yǎng)成分不足等缺陷[16－17]。因此，本試驗(yàn)采用牛奶與豆?jié){混合發(fā)酵釀造，通過(guò)優(yōu)化其發(fā)酵工藝條件，以期釀出的酒體風(fēng)味優(yōu)雅、口感幼滑、酸度適中的復(fù)合奶酒，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

釀酒酵母，大豆、牛奶、白砂糖，冰乙酸（分析純），乙酸鈉（分析純），檸檬酸（分析純），氫氧化鈉（分析純），亞硫酸鈉（分析純），硫酸銅（分析純），酒石酸鉀鈉（分析純），次甲基藍(lán)。

1.2 儀器與設(shè)備

豆?jié){機(jī)（JYL-C91T型），超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD型），電子天平（FA20043型），低速大容量多管離心機(jī)（LXJ-IIB型），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（MC-GNP-9080型），不銹鋼手提式滅菌器（DSX-280A型），電冰箱（BCD-2HBSA型），精密pH計(jì)（PHs-3c型），酒精度測(cè)試儀（AT6000型）。

1.3 復(fù)合奶酒釀造工藝流程

復(fù)合奶酒釀造工藝流程為

操作要點(diǎn)：挑選顆粒成熟飽滿的大豆，去除其中的雜質(zhì)，清水洗凈后用5倍質(zhì)量的清水浸泡9~12 h；將浸泡好的大豆按1∶10的質(zhì)量比加水磨漿后根據(jù)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)的條件添加牛奶并煮沸，添加不同濃度的白砂糖并用檸檬酸溶液調(diào)pH值到5.0后添加0.02%的亞硫酸鈉，以抑制雜菌的生長(zhǎng)；在無(wú)菌條件下接入一定量的經(jīng)活化后的酵母菌懸液，25℃發(fā)酵，待發(fā)酵完成后置于4℃的冰箱中后熟24 h。

1.4 方法

1.4.1 理化指標(biāo)測(cè)定方法

總糖（以葡萄糖計(jì)）測(cè)定采用斐林試劑法[18]，酒精體積分?jǐn)?shù)測(cè)定采用密度瓶法[18]，總酸測(cè)定采用電位滴定法[18]，氨基酸態(tài)氮測(cè)定采用甲醛滴定法[18]。

1.4.2 感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)在學(xué)院食品品評(píng)室內(nèi)完成，邀請(qǐng)13位教師及實(shí)驗(yàn)員組成評(píng)定小組，明確感官評(píng)定的指標(biāo)和注意事項(xiàng)。參照王璐等人對(duì)馬奶酒發(fā)酵條件的研究[6]、符楨華等人對(duì)豆?jié){酒的研究方法[13]及GB/T 2354-2009標(biāo)準(zhǔn)[18]對(duì)復(fù)合奶酒從色澤（滿分5分）、組織形態(tài)（滿分5分）、香氣（滿分30分）、滋味（滿分40分）、典型性（滿分20分）5個(gè)方面制定復(fù)合奶酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，如表1所示。

1.4.3 單因素實(shí)驗(yàn)

白砂糖添加量對(duì)復(fù)合奶酒發(fā)酵效果的影響：將豆?jié){與牛奶按照1∶1的體積比混合后煮沸，分別加入6%，12%，10%，12%，14%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，待冷卻后接入0.3%經(jīng)活化后的酵母菌，25℃發(fā)酵5 d后分別記錄復(fù)合奶酒的感官特征，以確定較佳的白砂糖添加量。

物料比對(duì)復(fù)合奶酒發(fā)酵效果的影響：將豆?jié){與牛奶分別按照3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3的體積比混合后煮沸，并添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，待冷卻后接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%經(jīng)活化后的酵母菌，25℃發(fā)酵5 d后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，以確定較佳的物料比。

表1 復(fù)合奶酒評(píng)分細(xì)則

接種量對(duì)復(fù)合奶酒發(fā)酵效果的影響：將豆?jié){與牛奶按照1∶1的體積比混合后煮沸，并添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，待冷卻后分別接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%經(jīng)活化后的酵母菌，25℃發(fā)酵5 d后分別進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，以確定較佳的酵母菌接種量。

發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)合奶酒發(fā)酵效果的影響：將豆?jié){與牛奶按照1∶1的體積比混合后煮沸，并添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，待冷卻后接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%經(jīng)活化后的酵母菌，在25℃的條件下分別發(fā)酵3，4，5，6，7 d并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，以確定較佳的發(fā)酵時(shí)間。

1.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken[19]的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，確定復(fù)合奶酒最佳的釀造工藝條件，因素水平如表2所示。

1.5 數(shù)據(jù)分析處理方法

以上每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。采用OriginPro 9.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)制圖和統(tǒng)計(jì)分析。Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 白砂糖添加量對(duì)復(fù)合奶酒感官評(píng)分的影響

控制處理?xiàng)l件為物料比（豆?jié){∶牛奶）1∶1（體積比）、接種量0.3%、發(fā)酵時(shí)間5 d，考察在白砂糖添加量質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6%，8%，10%，12%，14%時(shí)復(fù)合奶酒的感官評(píng)分，結(jié)果如圖1所示。

圖1 白砂糖添加量對(duì)復(fù)合奶酒感官評(píng)分的影響

圖1中，不相同字母表示差異顯著（P<0.05），下同。由圖1可以看出，當(dāng)復(fù)合奶酒中白砂糖添加量從6%增加到10%，復(fù)合奶酒的感官評(píng)分也隨之增加；當(dāng)添加量達(dá)到10%時(shí)，復(fù)合奶酒的感官評(píng)分達(dá)到最高分（76.25±0.87）分。但隨著白砂糖添加量的繼續(xù)增加，復(fù)合奶酒的感官評(píng)分開始呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)。可發(fā)酵性糖在復(fù)合奶酒發(fā)酵過(guò)程中主要轉(zhuǎn)化為乙醇，也可以轉(zhuǎn)化成酸類、酯類、醛類等物質(zhì)[14]。復(fù)合奶酒在發(fā)酵過(guò)程中，可發(fā)酵性糖偏少會(huì)出現(xiàn)酒體不豐滿、香味不足的現(xiàn)象，而可發(fā)酵性糖過(guò)多則會(huì)造成酒體酸度偏大等不良現(xiàn)象。故選用白砂糖添加量為8%，10%及12%用于后續(xù)響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 物料比對(duì)復(fù)合奶酒感官評(píng)分的影響

由圖2可以看出，豆?jié){能顯著改善牛奶酒的風(fēng)味特征，不僅能有效降低牛奶酒的酸度，而且能賦予牛奶酒獨(dú)特的風(fēng)味。復(fù)合奶酒的感官評(píng)分隨著復(fù)合奶酒原料中牛奶比例的增加而呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)物料比（豆?jié){∶牛奶）為1∶2（體積比）時(shí)，復(fù)合奶酒的感官評(píng)分達(dá)到最高的（83.52±0.77）分。因豆?jié){比例過(guò)大會(huì)造成復(fù)合奶酒香味較寡淡、豆腥味突出等不良特征，豆?jié){比例偏低又會(huì)使復(fù)合奶酒出現(xiàn)較高的酸度，因此當(dāng)豆?jié){與牛奶比例適當(dāng)時(shí)才能賦予復(fù)合奶酒特殊的風(fēng)味及克服奶酒與豆?jié){酒的缺陷。由此選擇物料比（豆?jié){∶牛奶）為1∶1，1∶2，1∶3作為后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素水平。

2.1.3 接種量對(duì)復(fù)合奶酒感官評(píng)分的影響

由圖3可以看出，隨著酵母菌接種量的不斷增加，復(fù)合奶酒的感官評(píng)分也隨之不斷增加。當(dāng)酵母菌接種量為0.5%時(shí)，復(fù)合奶酒的感官評(píng)分達(dá)到最高的（76.68±1.04）分。酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中能將可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為二氧化碳和乙醇，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生其他一些醇、醛、酸、酯等香味物質(zhì)[13]。當(dāng)酵母菌接種量偏低時(shí)，容易使釀酒原料不能完全發(fā)酵，造成復(fù)合奶酒酒度偏低、酒香不突出等現(xiàn)象。當(dāng)酵母菌的接種量為0.3%與0.4%時(shí)，其復(fù)合奶酒的感官評(píng)分雖然較酵母菌接種量為0.5%時(shí)低，但三者并無(wú)顯著性差異（P>0.05）。所以選擇酵母菌接種量為0.2%~0.4%用于響應(yīng)面法試驗(yàn)。

圖2 物料比對(duì)復(fù)合奶酒感官評(píng)分的影響

圖3 接種量對(duì)復(fù)合奶酒感官評(píng)分的影響

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)合奶酒感官評(píng)分的影響

控制處理?xiàng)l件：白砂糖添加量質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、物料比（豆?jié){∶牛奶）1∶1（體積比）、接種量0.3%，分別考察發(fā)酵時(shí)間為3，4，5，6，7 d時(shí)復(fù)合奶酒的感官評(píng)分，結(jié)果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)合奶酒感官評(píng)分的影響

由圖4可以看出，復(fù)合奶酒的感官評(píng)分隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為7 d時(shí)，復(fù)合奶酒的感官評(píng)分達(dá)到最高的（83.11±0.67）分。雖然復(fù)合奶酒的感官評(píng)分在其發(fā)酵6 d時(shí)較發(fā)酵7 d時(shí)偏低，但二者并無(wú)顯著性差異（P>0.05）。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間少于5 d時(shí)，醪液中的可發(fā)酵性糖還未完全被酵母菌所利用，酒體略顯寡淡，乙酸乙酯等酒香物質(zhì)含量偏低，使得復(fù)合奶酒的酒香不夠濃郁。因此選擇發(fā)酵時(shí)間為5，6，7 d用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面法試驗(yàn)，對(duì)白砂糖添加量、物料比（豆?jié){∶牛奶）、接種量、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素分析得到以下試驗(yàn)方案及結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

再通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面法試驗(yàn)得到的感官評(píng)分（見表3）進(jìn)行方差分析，得到結(jié)果如表4所示。

由表4可以看出，4個(gè)因素對(duì)復(fù)合奶酒感官評(píng)分影響的強(qiáng)弱順序依次為：接種量>發(fā)酵時(shí)間>物料比>白砂糖添加量，其中接種量對(duì)復(fù)合奶酒感官評(píng)分的影響顯著（P<0.05）。物料比與接種量之間具有極為顯著的交互作用（P<0.01）。設(shè)白砂糖添加量、物料比、接種量、發(fā)酵時(shí)間分別為A，B，C，D；以復(fù)合奶酒的感官評(píng)分為響應(yīng)值，經(jīng)多元回歸擬合后，得到復(fù)合奶酒感官評(píng)分回歸方程：復(fù)合奶酒感官評(píng)分=82.33-0.35A+0.46B-0.98C+0.62D+0.33AB+0.43AC-0.94AD+2.82BC+1.41BD-0.067CD-3.12A2-2.50B2-3.29C2-4.17D2。

根據(jù)表4中方差分析結(jié)果，復(fù)合奶酒感官評(píng)分的回歸方程描述與響應(yīng)面值之間的關(guān)系模型顯著（P<0.05），且失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著（P>0.05），表明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾較小，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ统浞謹(jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，復(fù)合奶酒感官評(píng)分的回歸方程是復(fù)合奶酒感官評(píng)分與復(fù)合奶酒發(fā)酵工藝各參數(shù)的合適數(shù)學(xué)模型，即可以利用此回歸方程確定復(fù)合奶酒釀造的最佳工藝[20]。

表4 方差分析

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因子所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上可形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用[21]。根據(jù)復(fù)合奶酒感官評(píng)分回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖結(jié)果如圖5所示。

由響應(yīng)面圖曲面坡度越陡峭、等高線越密集成橢圓形表示兩因素交互影響越大的原則[20-22]可知，因子B（物料比）與因子C（接種量）之間所形成的響應(yīng)面曲面坡度在兩因素交互作用響應(yīng)面圖中最為陡峭即因子B與因子C相互之間具有最強(qiáng)的交互作用。該結(jié)果與表4方差分析所得的物料比與接種量之間具有極為顯著的交互作用（P<0.01）的結(jié)論相吻合。

通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件分析確定復(fù)合奶酒的最佳發(fā)酵工藝條件為白砂糖添加量9.84%、物料比（豆?jié){：牛奶）1∶2.04（體積比）、接種量0.29%及發(fā)酵時(shí)間6.09 d，此條件下由公式算出的理論值為86.32分。根據(jù)所得的分析數(shù)據(jù)進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)的條件為白砂糖添加量9.8%、物料比（豆?jié){∶牛奶）1∶2（體積比）、接種量0.3%及發(fā)酵時(shí)間6.1 d，得到復(fù)合奶酒的感官評(píng)分為（86.07±1.04）分，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，偏差不大，證明該結(jié)果合理可靠。

2.3 理化指標(biāo)分析

經(jīng)測(cè)得復(fù)合奶酒在最佳發(fā)酵工藝條件下的總糖為11.6 g/L、酒精體積分?jǐn)?shù)5.3%，總酸質(zhì)量濃度7.9 g/L，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度0.24 g/L。4種理化指標(biāo)均符合中華人民共和國(guó)GB/T 2354-2009標(biāo)準(zhǔn)[18]。

圖5 兩因素交互作用對(duì)感官評(píng)分的響應(yīng)面

3 結(jié) 論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對(duì)復(fù)合奶酒的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，影響復(fù)合奶酒感官評(píng)分的工藝因素按主次順序排列為接種量>發(fā)酵時(shí)間>物料比>白砂糖添加量。最終確定了其最優(yōu)工藝條件為：將浸泡好的大豆按1∶10的質(zhì)量比加水磨漿后按照物料比（豆?jié){：牛奶）1∶2（體積比）加入牛奶煮沸，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.8%的白砂糖并用檸檬酸溶液調(diào)pH值到5.0后添加0.02%的亞硫酸鈉，在無(wú)菌環(huán)境條件下接入0.3%經(jīng)活化后的酵母菌懸液，在25℃條件下發(fā)酵6.1 d后置于4℃的冰箱中后熟24 h。此條件下可獲得色澤微黃透明、奶香與酒香和諧、酒體豐滿圓潤(rùn)的復(fù)合奶酒，其感官評(píng)分為86.07分。若需將此復(fù)合奶酒進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)還需對(duì)酒體進(jìn)一步勾調(diào)及澄清處理，使其感官特性符合商品要求。