干酪中的生物活性肽及其作用

焦晶凱，劉振民，蘇米亞，鄭遠榮，劉景

（乳業生物技術國家重點實驗室，光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海200436）

0 引 言

人們通常所說的干酪是使用凝乳酶、菌種、熱酸化的一種或幾種方法將牛奶凝乳形成，干酪也可以稱作奶酪。世界上的干酪可以根據牛乳來源、制作工藝、脂肪含量、發酵類型和所含菌種進行分類，其種類可以分為上千種[1]。

干酪生物活性肽在干酪成熟過程中產生，在這一過程中，牛乳中的各種蛋白酶、凝乳酶和LAB代謝酶類發揮重要作用，從而不斷的合成釋放多肽，其種類和數量受蛋白水解因素的影響，如pH值，酶的類型，鹽水比，濕度，儲存時間和溫度[2-3]，因此不同品種的干酪會產出不同生物活性的多肽，例如抗高血壓，抗氧化，抗增殖等活性，本文主要針對以上幾個類型的干酪活性肽就目前的研究進展進行概述。

1 抗高血壓肽

在發達國家，高血壓是影響多達30%成年人的慢性病，并可能誘發并發癥，如中風和冠心病。在人類系統中，其中控制血壓的一種生理途徑是腎素-血管緊張素-醛固酮系統。該系統的關鍵組成部分是血管緊張素I轉換酶（ACE），它可以催化血管緊張素I向血管收縮劑血管緊張素II轉化，并同時降解血管擴張劑緩激肽和胰激肽。這兩個反應導致血管收縮和醛固酮釋放，增加鈉濃度和血壓。因此，抑制這種酶可以起到降壓作用。世界大多數高血壓患者在接受治療時使用ACE抑制藥物如卡托普利或依那普利。隨著牛奶發酵和成熟過程中釋放的多肽序列鑒定，干酪已被廣泛作為ACE抑制劑的潛在來源。表1為部分干酪的水溶性和/或乙醇溶性提取物（WSE，ESE）及其相應的ACE抑制活性。有學者鑒定了來自Roquefort-type干酪的多肽,序列為YQGPIVLNPWDQVKR，與αS2酪蛋白具有相似序列，此干酪表現了較強ACE抑制活性[4]。一些含有VPP和IPP序列的多肽具有ACE-抑制活性，有學者在布里干酪（Brie）、切達干酪（Cheddar）、艾達姆干酪（Edam）、高達干酪（Gouda）、戈爾貢佐拉（Gorgonzola）和格魯耶爾（Gruyere）及其他一些干酪中發現了序列為VPP和IPP的抗高血壓β-酪蛋白肽[5-6]。Stuknytè等人[5]也在不同干酪如布里干酪（Brie）、切達干酪（Cheddar）、戈爾貢佐拉（Gorgonzola）和馬斯丹（Maasdam）等干酪中鑒定了酪蛋白水解產物中含有抗高血壓αs1-酪蛋白衍生肽AYFYPEL和RYLGY。雖然在一些干酪提取物中發現ACE抑制活性肽及一些抗高血壓肽的存在，但仍需進一步在動物模型中證實干酪的抗高血壓作用。

表1 部分干酪中血管緊張素I轉換酶（ACE）抑制活性及鑒定作用多肽

2 抗氧化肽

由于活性氧產生增加引起（ROS）的氧化應激，會引起細胞的抗氧化能力下，進而會引發一系列人類疾病，包括心血管疾病，代謝疾病，炎癥，神經退行性疾病和癌癥并且加速老化過程。天然抗氧化劑可以對氧化應激進行內源性抵抗，食物中所含有的肽是天然的抗氧化劑，沒有嚴重的副作用。其中，牛奶蛋白質是最重要的天然肽來源之一[10-11]。

有學者測定了巴爾米賈諾雷吉亞諾（Parmigiano-Reggiano）干酪水溶性多肽提取物的自由基清除活性，其抗氧化活性完全不受成熟時間和胃腸消化的影響[12]。Meister Meira等人[5]測定了巴西的菲達干酪（Fata）、洛克福干酪（Roquefort-type）和羊乳干酪（Pecorino-type）的水溶性提取物抗氧化活性，結果顯示菲達干酪、洛克福干酪的ABTS清除自由基能力分別是32%~45%和87%。Roquefort-type干酪的DPPH自由基清除活性最強，其序列與以前表征過具有抗氧化活性的肽有很高的同源性。最近，在布爾戈斯型（Burgostype）干酪中鑒定出三種來源于αs1-和β-酪蛋白的肽。其中一種同源于αs1-酪蛋白（SDIPNPIGSENSEKTTPLLW），是一種新的肽，具有潛在的抗氧化活性[13]。這些結果表明干酪是抗氧化肽的良好來源，但仍需動物模型和人體試驗進一步驗證。

3 神經肽

類阿片藥物肽是一類具有興奮劑和拮抗作用的阿片μ-受體配體。研究得最多的乳源阿片受體配體是由β-酪蛋白衍生的一類肽，稱為β-酪啡肽（BCM）。除了對中樞神經系統的影響之外，BCMs已被證明能夠誘導腸粘液分泌、增加血漿胰島素水平、降低胰高血糖素水平、并提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性[14-15]。UIHaq等人[16]還找到了BCMs的其他一些益生作用。

Sienkiewicz-Szlapka等人[17]測定了三個半硬質干酪（艾達姆Edamski、高達Gouda和卡斯特蘭Kasztelan）以及兩種成熟霉菌干酪（布里Brie和羅克波爾Rokpol）中的類阿片肽含量，包括具有興奮劑作用BCM7和BCM5、拮抗作用的casoxin-6和casoxin-C（衍生自牛κ-酪蛋白）和乳鐵蛋白A（衍生自乳鐵蛋白）的含量。發現霉菌干酪中BCMs的含量高于半硬干酪，它含有相當高的casoxin-6。除Gouda外，所有其他干酪提取物都被發現能夠影響分離的兔回腸的腸動力，類似于嗎啡作用。類似的，DeNoni和Cataneo[18]測定了戈爾貢佐拉Gorgonzola、山羊干酪Caprino,、布里 Brie、意大利 Taleggio、高達 Gouda、芳提娜Fontina、切達Cheddar和格拉納帕達諾GranaPadano干酪及其消化產物中BCMs含量，除了Taleggio、Caprino和GranaPadano干酪，均檢測出BCM7。隨后Toelstede等人[19]也證實在成熟的Gouda奶酪的WSE中存在BCM10（β-酪蛋白（60-69））。在意大利山羊干酪CaprinodePiemonte的WSE中也發現BCM9[20]。

關于類阿片藥物肽的實際生物利用度研究較少，僅在喂食2周和4周齡含酪蛋白配方食物的小鼠血漿中檢測到BCM[21]。在喂食母乳和牛乳的嬰兒血漿中檢測到了具有免疫反應性的BCMs[22]。有必要繼續探索BCMs在人類健康中的作用，以及應用改進的診斷技術進行體內實驗驗證。此外，還需要更多的研究來評估這些肽在復雜的食物基質中的吸收程度。

4 抗增殖肽

已經有一些體內體外實驗研究了牛奶蛋白（如乳鐵蛋白和乳鐵蛋白）具有抑制癌細胞的生長能力，主要作用是在腫瘤生長中充當細胞凋亡誘導劑。然而，相應抗增殖特性的肽序列并沒有鑒定出來。截至目前，有研究驗證了干酪提取物具有抗增殖作用，但所有描述的結果都基于干酪提取物或干酪乳清，并非干酪本身。Yasuda等人[23]驗證了12種商業干酪提取物對細胞生長和HL-60人早幼粒細胞白血病細胞中誘導DNA斷裂中起到的作用。其中蒙塔格納德干酪Montagnard，蓬萊韋克干酪Pont-l'Eveque，布里干酪Brie，卡門貝爾干酪Camembert，丹麥藍紋Danablue和藍紋干酪Bluecheese提取物具有最高的抗增值活性。還指出，不同干酪成熟度與它們的抗增殖活性之間呈正相關。

有學者研究馬蘇里拉干酪的乳清樣品可以減少43%的Caco2細胞的增殖。從原奶中提取的多肽并沒有這種作用，說明特定的生物活性物質是在干酪的生產過程中釋放的[24]。隨后，該學者使用RP-HPLC純化多肽片段，并使用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜MALDI-TOF/MS進一步鑒定這些活性多肽，大多是由κ-酪蛋白肽和β-酪蛋白衍生而來[25]。

5 抗菌肽

迄今為止，幾乎所有公開發表出版物涉及的干酪的抗菌特性都是基于水溶性多肽提取物質WSE的，而且很少有鑒定其中的功能性多肽序列。Théolier等人[26]測定了來自五種商業奶酪（莫扎里拉干酪，高達干酪，瑞士干酪，以及中度和重度成熟的切達干酪）的WSE的抗菌活性，在通過Sep-Pakclean柱分離以前，莫扎里拉和高達干酪的WSE可以抑制高達4.66個對數周期的李斯特菌ListeriaivanoviiHPB28、單核細胞增生李斯特氏菌ScottA3、大腸桿菌MC4100和大腸桿菌O157：H7。但是，在脫鹽后，幾乎沒有抗單核細胞增生李斯特氏菌ScottA3和大腸桿菌O157：H7的活性，這就難以說明抗菌性來自干酪的WSE還是其中的有機酸或鹽，該研究凸顯了在測定干酪的WSE活性之前，純化步驟的重要性。莫扎里拉、高達和瑞士干酪脫鹽后的WSE可以誘導幾種食源性霉菌的孢子萌發延遲。此外，還有學者[27]研究了阿西雅格干酪Asiagod'Allevo純化后的WSE活性，表現出對威爾斯李斯特菌L.innocuaLRGIA01有一定的抗菌性能。埃門塔爾干酪EmmentaldeSavoie純化的WSE也被證實具有抗單核細胞增生李斯特氏菌菌株162的活性[28]。雖然迄今為止，沒有公開發表的體內研究數據直接表明食用干酪具有抗菌影響。但是，一些干酪提取物被證實確有一定的抗菌作用。

6 礦物質吸收的調節肽（磷酸肽）

磷酸肽CPPs是具有不同程度磷酸化的生物活性肽，它通過體外和體內釋放的酶不同程度的水解酪蛋白形成的。因為這些肽具有較高凈負電荷，它們可以有效地結合二價陽離子形成可溶性復合物。因此磷酸肽是防齲的有效物質。除了具有金屬螯合性能外，CPP還具有其他生物活性，如抗氧化、免疫調節、胃分泌調節、抗菌劑以及對成骨細胞生長和分化的刺激活性[29-30]。

近年來，一些研究已經從不同類型干酪中分離、表征和鑒定了CPPs。通過分析總的WSE和濃縮沉淀的方法分析驗證CPPs的存在。盡管許多干酪品種中的酶是共通的，但是不同干酪的肽組份都是獨特的，并且受到成熟過程的影響。在Comté干酪中，β-和αs2-酪蛋白的原始切割歸因于纖溶酶，這是一種堿性牛奶蛋白酶，其具有切割β-酪蛋白的K28-K29和αs2-酪蛋白的K21-Q22的胰蛋白酶的特異性。這兩種肽通過內肽酶和氨肽酶以及賴氨酰羧肽酶的作用進一步水解。因此CPPs可以被認為是干酪中暫時存在的中間成分。它們要么積聚，要么被干酪酶降解成更短的肽和游離氨基酸，包括磷酸化的絲氨酸，大多數CPPs來自β-酪蛋白的區域（14-28）。特定肽的積總是取決于生產和降解酶與母體底物可利用性之間的微妙平衡。在Ragusano干酪的中，鑒定的可溶性肽的數量在成熟4個月和7個月后分別從123顯著降低至47和25[31-32]。

據報道，CPPs在腸道釋放并在發生礦物質吸收的小腸（回腸）的底部積聚。因此，一些研究旨在研究CPPs是否可以增加礦物質吸收，尤其是Ca2+吸收。雖然這些研究為CPPs改善礦物質吸收提供了可觀的證據，但結果仍存在爭議[33]。CPPs的作用影響也可能受到群體身體狀況、CPPs水平和鈣磷比值的影響。

表2 部分干酪中來自于αs1-，αss-和β-酪蛋白的磷酸肽

（續表2）

7 結 論

干酪在世界各地被廣泛的消費，并且在對人類的健康中發揮重要作用，例如，降血壓和抗氧化等。干酪的組成證明了它是一個良好的生物活性物質釋放基質。雖然已有大量的研究證明干酪中的肽能給人類的健康帶來益處，但是仍有必要通過一定的技術手段進一步鑒定分離生物活性肽，如代謝組學的應用。此外，實施新鮮和成熟干酪中生物活性肽對健康影響的體內和體外研究證明也是相當必要的。