二維液相色譜法檢測嬰幼兒奶粉中的牛磺酸

鄭國建，沈龍天鳴，林毅侃，王承平，楊保剛

（上海市質量監督檢驗技術研究院，上海 200233)

0 引 言

牛磺酸(Taurine)又名2-氨基乙磺酸，是人體重要的氨基酸，可促進大腦的損傷修復[1,2]、提高免疫力[3]、減輕炎癥反應[4]、促進視覺機能的發育[5]。

目前用于食品中牛磺酸測定的方法主要包括液相色譜法[6-11]和液相色譜串聯質譜法[12-14]。由于食品中牛磺酸含量高，且液相色譜串聯質譜儀價格昂貴，所以主要使用液相色譜法，如國家標準GB5009.169-2016[15]。該標準第一法為柱后衍生法。由于該方法使用的色譜柱價格高，且需要使用柱后衍生裝置，對實驗室要求較高，所以大多數實驗室使用標準中的第二法，既丹磺酰氯柱前衍生法。但在第二法中某些基質樣品中的雜質會對牛磺酸檢測產生干擾。本研究將建立一種二維液相色譜法檢測嬰幼兒配方奶粉中的牛磺酸，該方法具有準確性高、重復性好、操作簡便等優點。

1 實驗

1.1 材料與試劑

牛磺酸標準品，丹磺酰氯為分析純，鹽酸甲胺為分析純，甲酸、三氟乙酸、甲醇、乙腈為色譜純，亞鐵氰化鉀、乙酸鋅為化學純，超純水（由Millipore Milli-Q超純水儀生產）。

1.2 儀器與設備

Thermo U 3000雙三元高效液相色譜儀，配有紫外檢測器(DAD)、熒光檢測器(FLD)和一個六通閥；Eppendorf 5804離心機；Wiggens Votex 3000渦旋振蕩儀。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

第一維色譜柱：Agilent XDB-C18：3.0 mm×150 mm，3.5μm；第二維色譜柱：Thermo Gold PFP(全氟苯基柱)：4.6 mm×150 mm，5μm。

A1和B1流動相對應泵1，A2和B2對應泵2，流動相A1為甲醇，流動相A2為乙腈，流動相B1為質量分數0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B2為質量分數0.1%甲酸水溶液。泵1的流速為0.4 mL/min，泵2的流速為1 mL/min；柱溫為35℃；進樣量10μL；一維使用紫外檢測器，其檢測波長為254 nm；二維使用熒光檢測器，其激發波長為330 nm，發射波長為530 nm。泵1和泵2的梯度如表1所示。

表1 二維液相色譜流動相梯度

1.3.2 標準溶液的配制

標準儲備液(質量濃度約50 mg/L)：精密稱量5 mg標準品用水定容到100 mL。分別準確取適量上述儲備液，用水稀釋為質量濃度2，5，10，15，20 mg/L的溶液。

1.3.3 樣品處理

樣品處理過程參照GB 5009.169-2016[15]第二法：準確稱取1 g樣品(精確到0.1 mg)于50 mL容量瓶中，加入30 mL水，渦旋10 s，放入超聲振蕩器中超聲提取10min。加入1.0 mL質量分數為15%亞鐵氰化鉀水溶液，渦旋混合，1.0 mL質量分數為30%乙酸鋅水溶液，渦旋混合，用水定容至刻度，充分混勻。樣液于8 000 r/min下離心3 min。

準確吸取1.00 mL上清液，1.00 mL濃度為80 mmol/L（pH值為9.5）碳酸鈉緩沖液，1.00 mL質量濃度為1.5 g/L丹磺酰氯溶液于10 mL離心管中，渦旋10 s，于室溫避光處靜置反應2 h(1 h后振搖1次)，加入0.10 mL質量濃度為20 mg/L鹽酸甲胺溶液渦旋混合，避光靜置至沉淀完全。取上清過0.22μm尼龍濾膜后進液相色譜分析。

2 結果與分析

基于多種分離機理的多維色譜可用于復雜基質中目標化合物的分離和定量測定[16-24]。其中的二維色譜技術結構簡單，對設備要求低，已經越來越多的應用到食品分析中[16,24-26]。

實驗對第二維色譜的的流動相進行了考察，分別考察了純水、質量分數0.1%三氟乙酸水溶液、以及質量分數0.1%甲酸水溶液作為B2相。實驗發現在使用純水時牛磺酸的色譜峰峰寬較寬，且對稱性差；使用酸性溶液能明顯改善峰型，而使用0.1%甲酸溶液時牛磺酸的熒光響應要大于在0.1%三氟乙酸水溶液中的響應（色譜圖未給出）。所以最終選擇0.1%甲酸水溶液作為B2相。

2.1 二維色譜流路構建與切換時間的確定。

2.1.1 閥切換時間的確定

為了保證將一維色譜柱中的牛磺酸全部切割到第二維色譜柱，首先使用標準品對一維色譜圖中的牛磺酸出峰位置進行確認，如圖1所示。由圖1可以看出牛磺酸在一維色譜柱的保留時間為4.7 min。因此將閥切換時間的設定在4.2 min和5.2 min。二維液相色譜的具體連接方法如圖2所示。在0~4.2 min，六通閥處于1、2連通狀態；在4.2~5.2 min，六通閥處于1和6連通狀態；5.2~15min，六通閥處于1和2連通狀態。

圖1 牛磺酸標準品一維色譜

圖2 二維液相系統連接示意圖

2.1.2 色譜柱的選擇

二維液相色譜既要考慮2個維度的體系的兼容性，又要考慮這2個維度存在一定的差異，因此該研究選用了C18作為第一色譜柱，PFP色譜柱作為第二色譜柱。在表1液相條件下，牛磺酸可以和雜質得到很好的分離，如圖3所示。

圖3 樣品中牛磺酸的二維液相色譜色譜

2.2 線性關系和檢出限

使用儲備液，用水稀釋成不同質量濃度的標準工作液，然后經過和樣品一樣的衍生過程反應后，過濾進樣分析。以標準工作液質量分數為橫坐標，峰面積為縱坐標制作標準曲線，該方法的線性相關系數r≥0.999。以3倍信噪比（S/N）計算方法的檢出限為0.02 mg/100g，以10倍信噪比(S/N)計算方法的定量限為0.05 mg/100g。GB5009.168-2016[18]第二法的定量限為0.1 mg/100g，該方法可以滿足日常嬰幼兒奶粉中牛磺酸的定量需求。

2.3 回收率和精密度

使用乳清粉進行加標回收率和精密度實驗。

以定量限、1倍目標值和1.5倍目標值三個水平進行加標回收實驗。結果如表2所示。

由表2可知：該方法加標回收率為97.8%~99.0%，相對標準偏差為2.56%~3.25%。表明方法回收率和精密度良好。

2.4 實際樣品檢測

采用該方法和GB5009.168-2016第二法[18]對市售的6種嬰幼兒配方奶粉，1個部分水解配方奶粉，以及1個有機奶粉原料進行測定，結果如表3所示。

表3 實際樣品檢測結果 mg/100g

由表3可以看出：對于1~6號樣品采用兩種方法得到的結果基本一致，結果偏差在小于5%。說明該方法在檢測普通嬰幼兒配方奶粉時和國標方法具有很好一致性。

在檢測部分水解配方奶粉時，使用GB5009.168-2016第二法測得的結果為65.2 mg/100 g，按產品能量為2 000 k J/100 g計算，牛磺酸的含量為3.26 mg/100 kJ，超出國標限量要求。使用該方法的測得值為1.84 mg/100 kJ，符合國標限量要求。

對于有機奶粉原料樣品，我們從供應商得知該樣品為還未添加牛磺酸的原料粉，其本底牛磺酸質量分數應該很低。但是使用GB5009.168-2016第二法得到的數值為29.5 mg/100 g，明顯大于該方法得到的9.12 mg/100 g。

從水解配方奶粉和有機奶粉原料的數據可以進一步說明使用該方法可很好的消除某些特殊基質樣品中的基質干擾，得到比國標方法更加準確的牛磺酸含量。

3 結論

本文建立了一種使用二維液相色譜檢測嬰幼兒配方奶粉中牛磺酸含量的檢測方法，對該方法進行了方法學驗證，該方法在2~20 mg/L質量濃度范圍內具有良好的線性，線性相關系數r≥0.999；定量限為0.05 mg/100g；在 0.05 mg/100g，40 mg/100g，60 mg/100g三個質量分數水平的加標回收在97.8%~99.0%之間，相對標準偏差為2.56%~3.25%。使用該方法對實際樣品進行檢測，證明該方法準確性高、重復性好、操作簡單，抗干擾能力強，適用于嬰幼兒奶粉中牛磺酸的測定。