牦牛酥油功能性中鏈脂肪酸（MCFA）和支鏈脂肪酸(BCFA)純化工藝研究

袁錦瑩,孫萬成,羅毅皓

（青海大學農牧學院，食品加工與安全，西寧810016）

0 引 言

牦牛酥油是以傳統手工工藝從牦牛乳中提煉出的奶油，能為人體提供充足能量，并且具有保健功能[1-2]。研究表明，牦牛酥油中飽和脂肪酸的組成及含量與普通牛乳極為相似[3-4]。其飽和脂肪酸（SFA）與不飽和脂肪酸（UFA）含量均高于普通奶油[5]。喻峰等[6-7]報道了牦牛酥油中的UFA對人體健康具有意義，但對于酥油當中的其他脂肪酸組分目前鮮有報道。

研究證實中鏈脂肪酸（MCFA）能夠降低體重、減少體脂及改善血脂代謝，對動脈粥樣硬化及心腦血管疾病帶來有益的作[8-10]。而支鏈脂肪酸（BCFA）對人體具有獨特而重要的功能和作用,如防止壞死性小腸結腸炎[11-12]，同時有研究表明BCFA還具有抗癌作用[13-14]。

尿素絡合是脂肪酸分離純化的傳統方法，利用尿素分子將SFA及MUFA絡合，以達到分離純化目的[15-16]。結晶溫度越低，尿素用量越多，所得純度越高[17]。基于此，本研究采用過氧乙酸氧化法除去不飽和組分原理，結合尿素絡合對牦牛酥油中的功能性脂肪酸進行分離純化，為牦牛酥油開發利用提供基礎數據。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

牦牛酥油，青海果洛；尿素，上海廣諾化學科技有限公司；氫氧化鉀，天津紅巖試劑廠；無水硫酸鈉，天津恒興化學試劑制造有限公司；無水乙醇，天津富宇精細化工有限公司；正己烷，天津富宇精細化工有限公司；過氧乙酸，天津富宇精細化工有限公司；正丁醇，天津富宇精細化工有限公司；三氟化硼甲醇，成都艾科達化學試劑有限公司；定性濾紙撫順東陽工貿有限公司；廣泛試紙，杭州試三科技有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平（JM-B 3003），諸暨市超澤衡器設備有限公司；恒溫振蕩器（THZ-32），常州國華電器有限公司；旋轉蒸發器（RE-2000B），上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；生化培養箱，上海躍進醫療器械有限公司；旋渦混合器（MVS-1），北京東方開物科學器材有限公司；醫用離心機（LC-04C），江蘇正基儀器有限公司；氣相色譜質譜聯用儀（DSQⅡ），賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 游離脂肪酸的制備

采用皂化-酸化法制取游離脂肪酸。酥油中的脂肪與堿發生皂化，生成脂肪酸鹽。此外其中的游離脂肪酸也可與堿發生中和反應，生成脂肪酸鹽。再經酸化，被有機溶劑萃取便可制得混合的游離脂肪酸。吳明一[22]在用尿素絡合純化葵花籽油的不飽和脂肪酸的研究中，便是采用皂化-酸化法制備混合脂肪酸。Udaya N等[23]在用尿素絡合法純化海豹油的omega 3系列多不飽和脂肪酸也是用同等方法制取混合脂肪酸。

1.3.2 脂肪酸甲酯的制備

取適量（30 g）游離脂肪酸，加入質量分數為1%的硫酸-甲醇溶液100 mL，錫紙封口后60℃水浴30 min。待冷卻后加入50 mL的正己烷及50 mL飽和NaCl溶液，萃取取正己烷層。正己烷層水洗至呈中性后，再次萃取出正己烷層，用適量無水Na2SO4吸水干燥后過濾。濾液用旋轉蒸發儀（40℃）旋蒸獲得游離脂肪酸甲酯，低溫（-20℃）保存備用。

1.3.3 脂肪酸甲酯的過氧化

脂肪酸甲酯的過氧化目的是使不飽和脂肪酸的雙鍵氧化生成飽和脂肪酸。加入過氧乙酸（過氧化氫與乙酸1:1配置），設定三個單因素脂肪酸與過氧乙酸比值為1:1、1:2、1:3反應以判斷過氧化程度[24]。再加入正己烷進行萃取，取正己烷層。將正己烷層水洗至呈中性后，再次萃取出正己烷層，用適量無水Na2SO4吸水干燥后過濾。濾液用旋轉蒸發儀（40℃）旋蒸獲得過氧化后的游離脂肪酸甲酯，低溫（-20℃）保存備用。

圖1 過氧化去除不飽和脂肪酸及生成環氧脂肪酸

1.3.4 一次絡合

絡合結晶：取15 g上述過氧化后所得游離脂肪酸甲酯，加入脂肪酸與尿素比值1:2和甲醇（甲醇：尿素+脂肪酸甲酯，5:1）。封口后，60℃水浴并振蕩至澄清透明。放置冰箱4℃，8-10 h保存，絡合結晶。之后對所得液相和固相（結晶絡合物）進行抽濾，并用少量甲醇沖洗瓶壁和濾渣，獲得固相（UCF）和液相（NUCF）。

NUCF處理：用鹽酸溶液酸化至pH 2-3后加入飽和食鹽水。隨后用正己烷萃取，取正己烷層。水洗至呈中性后，再次萃取出正己烷層，用適量無水Na2SO4吸水干燥后過濾。濾液用旋轉蒸發儀（40℃）旋蒸獲得游離脂肪酸甲酯，低溫（-20℃）保存備用。

UCF處理：同NUCF。

1.3.5 二次絡合

取上述脂肪酸甲酯，加入適量KOH-甲醇溶液，封口后于恒溫振蕩器60℃1 h，并振蕩。用鹽酸溶液酸化至pH 2-3。隨后進行破乳、萃取、水洗及干燥、蒸發等步驟，獲得游離脂肪酸。之后進行丁酯化，用1%（W/W）的硫酸的正丁醇溶液酯化，得到丁脂，后續操作為破乳、萃取、水洗及干燥、蒸發得到脂肪酸丁酯。尿素絡合脂肪酸丁酯。（4℃，8-10 h保存后抽濾、酸化、破乳、萃取、水洗及干燥、蒸發），最終獲得脂肪酸丁酯。

1.3.6 GC-MS的前處理--甲酯化

甲酯化將脂肪酸中的高沸點不易揮發的組分轉化成低沸點易揮發的脂肪酸甲酯，以進行GC-MS分析。本研究以三氟化硼作為催化劑，對游離脂肪酸進行甲酯化。

取100微升脂肪酸樣，加入質量分數為15的BF3甲醇4 mL，封住試管口后，90℃水浴30~60 min，冷卻后加入2 mL的正己烷，振搖，加入2 mL的飽和食鹽水，振搖。3 500 r/min離心5 min。取正己烷層于另一支干燥試管中，加入少量無水硫酸鈉除濕，振搖。輕輕吸取正己烷層于新的干燥試管，在氮氣下吹干，此時油脂析出附著在管壁，用0.5 mL正己烷再次潤洗收集油脂得到甲酯化樣品以備GC-MS分析。

1.3.7 GC-MS分析

氣相色譜-質譜分析：柱子型號DB-5MS 60m×0.25 mm×0.25μm廣州費尼根儀器有限公司；色譜柱：柱子型號為ZB-5MS 60 m×0.25 mm×0.25μm。起始溫度60℃保持1 min，以10℃/min升至180℃，再以4℃/min升至280℃，保持20 min；再以20℃/min升至，保持2 min。進樣孔溫度為280℃。載氣：高純He(99.999%)，流速為1 mL/min。連接桿溫度為285℃。離子源溫度為250℃。溶劑延遲時間7 min。質量掃描范圍：40~550 u。

用化學工作站數據處理系統檢索譜圖庫，進行譜圖解析，確認各個脂肪酸的化學結構。用峰面積歸一化法定量計算各脂肪酸的相對含量。

1.3.8 計算

1.3.9 統計方法

利用SPSS 16.0軟件分析統計組的差異性，采用最小顯著差數法，計量數據用平均值±標準差，采用t檢驗，P＜0.05表示脂肪酸差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 富集相的確定

表1 固相（UCF）和液相（NUCF）脂肪酸成分對比

從表1可看出，尿素絡合后液相（NUCF）中的MCFA、PUFA及BCFA含量分別為15.72%、5.94%和13.67%，而在固相（UCF）中分別為3.9%、0.91%和1.2%。因此可判斷，尿素絡合純化牦牛酥油的中鏈脂肪酸（MCFA）及支鏈脂肪酸（BCFA）的富集相是液相（NUCF）。

2.2 不同比例過氧乙酸對過氧化程度的影響

2.2.1 不同脂肪酸/過氧乙酸比值對兩次絡合終產物的影響

表2 不同脂肪酸/過氧乙酸比值對兩次絡合終產物的影響

從表2可看出，脂肪酸/過氧乙酸不同比值對兩次絡合后的產物有不同影響，原酥油中的中鏈脂肪酸（MCFA）相對含量為6.37%、支鏈脂肪酸（BCFA）相對含量為3.31%、多不飽和脂肪酸（PUFA）相對含量為1.74%。兩次絡合后，脂肪酸/過氧乙酸比值1:2時MCFA的純度最高，達到28.66%，脂肪酸/過氧乙酸比值1:3時BCFA的純度最高，達到15.91%。C16:0、C18:1n9、C18:0等在原料酥油中含量較多，但在試驗處理后含量大幅度降低，主要的原因是尿素分子能夠較好絡合C16:0、C18:0，使其轉入到固相而去除；C18:1n9相對含量較大幅度降低的主要原因是其雙鍵被氧化形成環氧脂肪酸和飽和脂肪酸[21]。

2.2.2 脂肪酸/過氧乙酸比值1:3時各階段產物的脂肪酸成分變化

表3 脂肪酸/過氧乙酸比值1:3時各階段產物的脂肪酸成分比較

從表3可知，將脂肪酸甲酯過氧化后脂肪酸成分發生了顯著性差異（P<0.01），MCFA純度由最初的6.37%提高到67.7%，提高近10倍左右，可能原因是長鏈不飽和脂肪酸被強烈的氧化，在雙鍵位置發生斷裂，生成了中鏈脂肪酸。PUFA在過氧化后有一定程度的降低，兩次絡合后BCFA相對含量升高近5倍。尿素絡合法能夠分離純化BCFA，是因為尿素能夠絡合SFA及MUFA，與之形成較穩定的絡合物[16，21]。

由圖2和圖3可知，過氧化酥油產物中產生大量C10:0和C12:0，可能致使C18:1n9被強烈氧化，發生雙鍵部位的斷裂二生成C10:0和C12:0；也可能是由于尿素分子不能絡合C10:0和C12:0脂肪酸，而使其富集液相（NUCF）部分。

圖2 原酥油GC/MS圖譜（C8:0,RT11.55,area0.05%;C10:0,RT14.62,area0.54%;C12:0,RT17.94,area3.03%）

圖3 過氧化酥油GC/MS圖譜（C8:0,RT11.52,area15.37%;C10:0,RT14.58,area24.5%;C12:0,RT17.84,area25.1%;）

此外，在進行過氧化與兩次絡合后產生了新的中間產物—環氧脂肪酸甲酯，脂肪酸/過氧乙酸比值1:3時二次絡合后的相對含量為11.56%。環氧脂肪酸甲酯是類常用環保增塑劑，在塑料加工中添加增塑劑可使材料柔韌性增強。但普遍使用的增塑劑為人工合成的鄰苯二甲酸酯類化學物質，會對人體的生殖、免疫、消化系統帶來危害。環氧脂肪酸甲酯作為一種新型的高分子材料助劑，對人體無毒無害，其極性部分（包括酯基和環氧基團）可與聚氯乙烯（PVC）的極性部分相互作用，其非極性部分（直鏈烴基）介入PVC材料分子鏈間，削弱了分子鏈間的應力，從而增加了分子鏈的移動性、降低了分子鏈的結晶度，使PVC的塑性增加[22-23]。

3 結 論

經過過氧化處理后中鏈脂肪酸（MCFA）的純度達到67.7%，提取率為850%。純度比原酥油提高10倍左右。過氧化的最佳比值為脂肪酸/過氧乙酸1:3，兩次絡合條件為脂肪酸與尿素比值為1:3，支鏈脂肪酸（BCFA）純度達到15.91%，比原酥油提高5倍左右，得率為21.57%。此外還獲得純度較高的環氧脂肪酸甲酯，相對含量達到11.59%。根據結果表明，經過過氧化處理可有效提高酥油中的MCFA純度，并獲得新的中間產物環氧脂肪酸甲酯，具有一定研究意義，結合尿素絡合工藝也可有效提高BCFA純度，為牦牛乳制品的進一步開發利用提供新的理論依據。