不同類型熱處理方式對牛乳品質的影響

王象欣，張秋梅，魏雪冬，姜毓君，徐琳，鄂來明

（東北農業大學黑龍江省綠色食品科學研究院，乳品科學教育部重點實驗室，國家乳業工程技術研究中心，國家乳制品質量監督檢驗中心，哈爾濱150028）

0 引 言

牛奶熱處理的主要目的是為了殺死微生物和滅活酶，熱處理的有效性和其對產品質量的影響主要與溫度-時間的組合、使用的加熱方式和牛奶的預處理條件有關[1-4]。目前，已經提出了幾種用于評估牛奶熱處理程度的方法，如使用熱處理時間-溫度組合的曲線積分（Time Temperature Integrators,TTIs）作為熱處理指數[5]。最常用的是堿性磷酸酶(ALP,EC 3.1.3.1)和乳過氧化物酶(Lpo,EC 1.11.1.7)的測定，其中ALP的活性作為一種熱處理強度指數廣泛用于評價牛奶巴氏殺菌是否徹底[6]，Lpo的活性用于區分巴氏殺菌牛奶。歐洲提議對未變性β-Lg的定量測定數值作為巴氏殺菌牛奶的熱處理上限[7]，巴氏殺菌牛奶中的未變性β-Lg濃度最低為2 600 mg/L，低于其數值說明已超過相應的熱處理工藝上限，其產品不符合巴氏殺菌牛奶的品質要求。美國Grade A規范中[8]，針對牛奶熱處理的工藝和設備，檢測指標高達40多項，并且與牛奶品質和安全相關的裝置及設備必須要使用鉛封，這也同時說明了熱處理工藝的重要性。不同熱處理工藝對牛奶中熱敏性活性蛋白α-乳白蛋白（α-lactoalbumin，α-Lac）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）和乳鐵蛋白（lactoferrin，Lf）的影響尚未得到廣泛研究。本研究的目的是通過對不同熱處理條件下熱敏性活性蛋白α-Lac、β-Lg和Lf的測定，來對比牛奶的熱損傷。

1 材料與方法

1.1 牛奶樣品的采集

保質期為12個月的UHT工藝牛奶20種（標記為UHT-1），保質期為1~6個月的UHT工藝牛奶20種（標記為UHT-2），巴氏殺菌牛奶15種，每種10個批次。以上樣品來自11個省份、自治區、直轄市的大型超市，并結合網絡抽取試驗所用樣品。INF工藝牛奶為實驗室自制，4個批次。

1.2 樣品熱處理方式

目前乳品工業中常用的熱處理方法見表1所示[3,8,11]。蒸汽浸入式直接殺菌（direct steam Infusion，INF）牛奶為實驗室自制，溫度為143~158℃，殺菌時間為0.05~0.5 s。INF殺菌是目前國際上一種先進的殺菌方式，它將牛奶勻速的通過小孔型分配板進入相對靜止的蒸汽罐中，當牛奶自由下落時與蒸汽融合，牛奶溫度升高，進而達到了殺菌的效果。而且在此過程中，可以對牛奶溫度、蒸汽溫度實現精準的控制，可使牛奶的殺菌溫度與蒸汽溫度之間的溫差達到1℃，因此產品中的維生素，乳球蛋白等營養物質的破壞程度小，營養成分保留更高，產品口感新鮮[12]。工藝流程如下。

生鮮牛乳收集→預熱（65~68℃）→殺菌（143~158℃）→真空冷卻脫氣→均質（64~66℃，20 MPa）→冷卻（10℃）→成品

表1 乳品加工中常用的熱處理方式

1.3 分析方法

α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白的檢測方法為本實驗室內部方法，并且參照GB/T 27417-2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》對方法進行了確認，滿足標準各項要求。

1.3.1 乳鐵蛋白

稱取10 g（精確至0.01 g）牛奶樣品于100 mL三角瓶中，先加入30 mL結合緩沖液（84 mmol/L Na2HPO4，16 mmol/L NaH2PO4），渦旋振蕩混勻1 min，將樣品全部轉移至容量瓶，再加入結合緩沖液定容至50 mL后混勻；將樣本轉移至離心管于4℃條件下以12 000 r/min轉速離心10 min，離心后輕輕取出中間層，上層有脂質，下面有沉淀，用大量程的移液器將中間液體部分吸出，注意不要吸取上層脂質和下層沉淀。取其中的10 mL作為樣品提取液。

肝素親和柱先加入5 mL結合緩沖溶液（84 mmol/L Na2HPO4，16 mmol/L NaH2PO4）平衡，處理完畢后加入樣品提取液，待樣液完全流出后，再用10 mL淋洗液（42 mmol/L NaH2PO4），8 mmol/L NaH2PO4），100 mmol/L NaCl）淋洗，棄去全部流出液。最后用2.5 mL洗脫液（42 mmol/L NaH2PO4），8 mmol/L NaH2PO4），1 mol/L NaCl）洗脫，收集全部流出液，定容至3.5 mL。將收集溶液過濾膜，供液相色譜檢測分析用。通過BEH300 C4色譜柱（Waters，100 mm×2.1 mm，1.7μm，300?）進行分離。梯度洗脫，流動相A為含有0.1%三氟乙酸的水溶液；流動相B為含有0.08%三氟乙酸的乙腈；梯度條件見表2所示，流速為0.3 mL/min，柱溫為60℃，進樣量為10μL；通過紫外檢測器280 nm下進行檢測。

表2 乳鐵蛋白梯度洗脫條件

1.3.2α-乳白蛋白和β-乳球蛋白

取5 g（精確至0.01 g）牛奶樣品至50 mL離心管中，加入15.0 mL水混勻，加入冰醋酸（約30μL）調節pH為4.6±0.1左右，渦旋震蕩1 min，室溫靜置至少20 min后，在10 000轉，4℃條件下離心10 min。取1 mL上清液稀釋10倍后，過0.22μm濾膜，上機檢測。通過BEH 300 C4色譜柱（Waters,100 mm×2.1 mm，1.7μm，300?）進行分離。梯度洗脫，流動相A為含有0.1%三氟乙酸的水溶液；流動相B為含有0.08%三氟乙酸的乙腈；梯度條件見表3所示，流速為0.3 mL/min，柱溫為60℃，進樣量為10μL；通過紫外檢測器280 nm下進行檢測。

表3 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白梯度洗脫條件

1.4 結果分析方法

所得數據采用統計軟件SPSS和Excel進行數據處理及統計學分析。對于分析處理所得的數據，根據GB/T 6379.2-2004《測量方法與結果的準確度（正確度與精密度）第二部分：確定標準測量方法重復性與再現性的基本方法》中的相關公式，計算相對標準值偏差CV%（變異系數），并用獨立樣本t檢驗進行顯著性校驗，P<0.5表示顯著性差異，P>0.5表示無顯著性差異。

2 結果和討論

2.1 對不同工藝熱處理牛奶的結果分析

熱處理的評估基于圖1，圖2中的色譜圖和表4中的實驗數據分析的結果，圖1中β-Lg A和β-Lg B為β-Lg的兩種遺傳變異體。試驗結果表明，不同的熱處理方式，牛奶中α-Lac、β-Lg和Lf含量差異顯著。

UHT滅菌工藝牛奶中Lf含量均小于檢出限（見表4所示），熱處理后α-Lac和β-Lg的含量和未經過熱處理的生乳比較已經大量減少，其中UHT-1滅菌牛奶α-Lac的含量最低為63 mg/L，β-Lg的含量最低為69mg/L；UHT-2滅菌牛奶α-Lac的含量最低為69 mg/L，β-Lg的含量最低為102 mg/L。UHT-2滅菌牛奶中α-Lac和β-Lg的含量平均值高于UHT-1滅菌牛奶，說明UHT-1滅菌牛奶熱處理強度高于UHT-2滅菌牛奶，因此從營養角度來說，UHT-2滅菌牛奶優于UHT-1滅菌牛奶。UHT-1滅菌牛奶的保質期均為常溫下一年，高于UHT-2滅菌牛奶的常溫1~6個月，因此UHT-1滅菌牛奶需要更高的熱處理強度才能滿足其貨架期需要。比較兩種UHT滅菌牛奶中α-Lac和β-Lg含量的CV%（變異系數）均大于40%，獨立樣本t檢驗進行顯著性校驗結果為P<0.5，說明UHT滅菌牛奶間品質差異明顯。

抽取的市售15種巴氏殺菌牛奶中，α-Lac含量最大值為963 mg/L，最小值為624 mg/L；β-Lg含量最大值為3 557 mg/L，最小值為1 548 mg/L；Lf含量最大值為38 mg/L，最小值為12 mg/L。15種巴氏殺菌牛奶樣品中，5種樣品的β-Lg含量小于2 600 mg/L，說明其加熱程度超過了巴氏殺菌的加熱上限[7]，原因或為延長貨架期，但對其營養價值有一定的影響。巴氏殺菌工藝牛奶的β-Lg和Lf的含量CV%均大于20%，獨立樣本t檢驗進行顯著性校驗結果為P<0.5，可以判巴氏殺菌工藝牛奶品質間的差異很大，加熱強度高低對牛奶品質影響顯著。

圖1 牛奶樣品中α-Lac和β-Lg的色譜圖

圖2 牛奶樣品中Lf的色譜圖

2.2 蒸汽浸入式直接殺菌（INF）牛奶

本實驗測試了來自3個不同牧場的生乳中α-Lac、β-Lg和Lf的含量（表5所示），其中未經處理的生乳中β-Lg的含量高于Claeys等報道的3 300~3 500 mg/L的平均值[13]；α-Lac的含量低于Jeanson等報道的1 310~1 840 mg/L的平均值[14]。Lf的含量與Riechel等報道的檢測結相當[9]，低于Harmon等報道的檢測結果[10]。

表4 不同熱處理條件下未變性α-Lac、β-Lg、Lf的含量

成品中α-Lac，β-Lg和Lf的含量檢測見表5，觀察到α-Lac的變性率（處理后變性α-Lac占處理前α-Lac的百分比）為24.9%，β-Lg的變性率為39.5%，Lf的變性率最高，為78.7%，與文獻中報道的變性率相當[15-16]。也可以判斷出3種活性蛋白的熱敏感順序為：Lf<β-Lg<α-Lac。

試驗使用的生乳來自牧場3，按照1.1所述INF殺菌進行處理，并在預熱、殺菌、均質、成品4個工藝階段取樣，冰水浴快速降溫，檢測α-Lac，β-Lg和Lf的含量，結果見表6所示，可以看出隨著熱處理強度的增大，α-Lac，β-Lg和Lf的含量均有一定減少。通過對處理后未變性α-Lac，β-Lg和Lf的含量與生乳中α-Lac，β-Lg和Lf的含量的比率作圖（圖3所示），可以觀察到，殺菌后α-Lac剩余77.2%、β-Lg剩余61.7%、Lf僅剩余21.4%，成一定趨勢。

表5 生乳和蒸汽浸入式直接熱處理殺菌牛奶中未變性α-Lac、β-Lg、Lf的含量（n=10）

表6 工藝不同階段未變性α-Lac、β-Lg、Lf的含量（n=10）

圖3 工藝不同階段未變性α-Lac、β-Lg、Lf比率趨勢圖

INF殺菌工藝因為與加熱介質（蒸汽）的直接接觸，然后通過真空立即冷卻，熱傳遞效率高，從而限制了由于過量熱暴露而導致的產品質量損失。比較殺菌階段的時間-溫度曲線下的面積[5]，也可以說明生乳在這幾種工藝下總的熱暴露，INF殺菌的熱暴露最小，對牛奶的熱損傷最小，其優于管式或板式熱交換的間接加熱。蒸汽的直接熱傳遞由于不存在傳熱表面，也極大的減少了熱損傷和結渣。Lee和Sherbon[17]的研究指出，與熱處理前均質比較，熱處理后再均質的牛奶中α-Lac和β-Lg的含量更高，說明均質和熱處理的順序可能對牛奶中活性蛋白的含量產生影響。熱處理使乳清蛋白變性，其可共價結合到酪蛋白膠束的表面或天然乳脂肪球膜上。加熱處理減少了乳脂肪球膜上的游離巰基，增加了其上面的二硫鍵，也說明β-Lg是通過二硫鍵與與膜蛋白結合[17]。均質使脂肪球破裂變小，乳脂肪球膜上更多活性位點（游離巰基）得到釋放，均質后熱處理使乳脂肪球膜更易結合α-Lac和β-Lg。而本試驗工藝為熱處理后真空脫氣冷卻后均質，冷卻過程使反應活化能降低，α-Lac和β-Lg不易與乳脂肪球膜結合。

2.3 不同熱處理方式的比較

根據圖4可以分析出不同熱處理方式對牛奶中熱敏性天然活性蛋白的含量有顯著影響，INF工藝優于UHT滅菌，與巴氏殺菌相當（P>0.5），INF工藝在延長保質期的同時（低溫條件21 d），降低了對牛奶的熱損傷。UHT滅菌牛奶的過熱加工和長期保存，在一定程度上降低了牛奶的品質。

圖4 不同工藝牛奶中活性蛋白含量平均值對比圖

3 結 論

通過比較不同方式熱處理的牛奶與INF殺菌牛奶中α-Lac，β-Lg和Lf的含量，得出INF殺菌對牛奶中的α-Lac，β-Lg和Lf的熱損傷程度低于UHT滅菌（P<0.5），與巴氏殺菌相當（P>0.5），其產品的保質期在冷藏條件下可達到21 d，貨架期高于巴氏殺菌牛奶。通過對不同工藝熱處理條件下數據的變異系數進行分析，可以判斷出巴氏殺菌牛奶、保質期12個月的UHT工藝牛奶和保質期1~6個月的UHT工藝牛奶，其品質間差異都很大，所以需要嚴格控制牛奶的熱處理工藝，盡可能對牛奶中的功能性成分天然活性蛋白含量最大保留。同時，應當建立相應的檢測方法，監控市售牛奶產品中的活性蛋白成分含量，以加強對液態奶過熱加工的風險評估。