白芨高效再生體系建立及工廠化育苗技術(shù)研究

王雙雙，張仁波，張柏林，竇全麗

(遵義師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院， 貴州遵義 563006)

白芨(BletillastriataL.)為蘭科(Orchidaceae)白芨屬，多年生宿根草本植物，是我國(guó)名貴中草藥。在《本經(jīng)》《本草逢原》等我國(guó)古代多部醫(yī)學(xué)著作中都有白芨入藥的記載，有收斂、補(bǔ)血、止血與消腫等多種功效[1-2]，白芨含有黏膠質(zhì)、多糖類、菲類與花青素類化合物等多種成分，其藥用成分主要為其富含的白芨膠質(zhì)，除了其藥用價(jià)值，也可作為天然懸混劑、增稠劑、潤(rùn)滑劑、乳化劑和保濕劑等廣泛應(yīng)用于化妝品、日化與食品等工業(yè)領(lǐng)域，應(yīng)用前景巨大[2-3]。野生白芨多分布于海拔較高的丘陵、低山溪谷邊及隱蔽草叢中或林下濕地[4]，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境條件要求苛刻，此外由于白芨種子自身發(fā)育特點(diǎn)使其在自然條件下萌發(fā)率很低，生長(zhǎng)較慢[5]，傳統(tǒng)的繁殖方式主要進(jìn)行分株繁殖，但缺點(diǎn)是耗種量大，效率低，周期較長(zhǎng)，不能滿足大規(guī)模種植的需要，而且野生白芨資源急劇減少，已被國(guó)家列為珍稀瀕危的保護(hù)植物[4]。目前白芨的組培和快繁方法的探索一直備受關(guān)注，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得大量組培苗，是解決生產(chǎn)用苗短缺的有效方法之一。目前在白芨組培研究中，外植體選擇種類較多，主要有塊莖[6]、種子[7-9]、幼根[10]等，由于白芨種子數(shù)量極多，也不會(huì)對(duì)種苗造成影響，其無菌萌發(fā)過程已發(fā)展成白芨主要的育苗手段。在白芨種子萌發(fā)階段，張燕等[8]研究認(rèn)為原球莖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方是1/2MS+5.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA，增殖倍數(shù)為2.71；葉靜等[11]發(fā)現(xiàn)種子萌發(fā)的最適培養(yǎng)基配方是1/2MS +1.0 mg/L 6-BA +1 %活性炭；劉敏等[12]研究發(fā)現(xiàn)最適合原球莖誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為1/2MS+ 1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA；在白芨種子萌發(fā)階段，研究者較多選擇激素6-BA和NAA誘導(dǎo)種子萌發(fā)，效果較好，但是激素使用的濃度和配比存在很大差異，出現(xiàn)組培苗長(zhǎng)勢(shì)較弱，增殖率較低的問題。 本研究利用白芨種子誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖，對(duì)芽進(jìn)行增殖和分化、生根以及馴化移栽的研究，從而對(duì)白芨高效快速繁殖體系優(yōu)化，解決其增殖率低和幼苗長(zhǎng)勢(shì)弱等存在的問題。以白芨種子為外植體，1/2MS或MS為基本培養(yǎng)基，通過添加不同濃度配比的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，篩選最適合原球莖的誘導(dǎo)、芽的增殖與分化以及生根培養(yǎng)的條件，優(yōu)化白芨高效再生技術(shù)體系，為其工廠化生產(chǎn)和應(yīng)用提供參考和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮白芨蒴果取自貴州赤水石堡鄉(xiāng)，由遵義師范學(xué)院張仁波教授鑒定，選取果莢飽滿未開裂的植株，帶回實(shí)驗(yàn)室后，采下蒴果進(jìn)行無菌處理。

1.2 方法

1.2.1 無菌系建立

將白芨蒴果置于洗潔精溶液中浸泡20 min，流水沖洗30 min，吸水紙吸干表面水分，待用。置于超凈工作臺(tái)上，75 %的乙醇消毒處理30 s，無菌水浸洗2～3次，然后用0.1 %升汞消毒處理12 min，期間多次振蕩，之后用無菌水沖洗5～6次，放置在滅菌后的濾紙上吸干表面水分。用滅菌后的解剖刀沿著白芨蒴果棱剖開，用鑷子將種子抖落在濾紙上，然后用接種鏟將種子鏟起，接種于培養(yǎng)基上，以覆蓋培養(yǎng)基大部分且種子無堆疊為宜。

1.2.2 白芨種子誘導(dǎo)原球莖的產(chǎn)生

實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)了12組培養(yǎng)基配方，1/2 MS作為基本培養(yǎng)基，研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA (0、1.0、1.5 mg/L)和NAA(0、0.1、0.5、1.0 mg/L)不同的質(zhì)量濃度組合，對(duì)原球莖產(chǎn)生和生長(zhǎng)的影響。培養(yǎng)基滅菌前調(diào)節(jié)pH值至5.8～6.0，121 ℃滅菌20 min。每處理接種5皿。接種完成的種子置于培養(yǎng)箱進(jìn)行暗培養(yǎng)5 d，再移至植物組培室培養(yǎng)。

在NAA和6-BA不同質(zhì)量濃度和配比處理下，培養(yǎng)22 d后觀察原球莖的誘導(dǎo)情況，用體視顯微鏡拍照，每配方隨機(jī)記錄5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)數(shù)目不少于50個(gè)，比較原球莖的直徑大小。

1.2.3 白芨原球莖芽的增殖與分化培養(yǎng)最適培養(yǎng)基的篩選

結(jié)合前期研究結(jié)果，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA (0.5、1.0、1.5 mg/L)和NAA(0.1、0.3、0.5 mg/L)，研究其不同質(zhì)量濃度組合，同時(shí)添加不同附加物土豆泥和香蕉泥，觀察對(duì)白芨原球莖增殖和分化的影響。

實(shí)驗(yàn)取材時(shí)，選擇相同條件下生長(zhǎng)一致的原球莖，接種于以上設(shè)定的培養(yǎng)基中，每個(gè)處理重復(fù)3次試驗(yàn)，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 白芨不定芽誘導(dǎo)生根培養(yǎng)

選擇1/2 MS 為基本培養(yǎng)基，添加附加物香蕉泥70.0 g/L。采用不同質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA(0、0.2、0.5、1.0 mg/L)進(jìn)行幼苗的生根試驗(yàn)。選取長(zhǎng)勢(shì)一致，具有 3～4片真葉的叢生苗，接種到設(shè)定的不同配方培養(yǎng)基中，每個(gè)處理重復(fù) 3 次試驗(yàn)，生長(zhǎng) 40 d后統(tǒng)計(jì)生根情況。

試驗(yàn)中所配培養(yǎng)基的瓊脂 6.5 g/L，蔗糖濃度 3 %，培養(yǎng)基 pH 調(diào)至5.8～6.0，121 ℃高壓滅菌 20 min。組培室培養(yǎng)條件設(shè)定為：光照強(qiáng)度 1 500～2 000 lx，光照周期為16 h光照/8 h黑暗，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，空氣濕度為 60 %～80 %。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用Excel、SPSS、SigmaPlot軟件處理分析，組間差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白芨種子誘導(dǎo)原球莖的產(chǎn)生

白芨種子細(xì)小，大多呈現(xiàn)紡錘形，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)約至 10 d，種子開始吸水膨大，由最初的淺褐色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色；22 d 左右便可觀察到種子變?yōu)榫G色小球狀體，產(chǎn)生原球莖。以 1/2 MS 為基本培養(yǎng)基，分別添加不同質(zhì)量濃度的 6-BA 和 NAA 誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖，結(jié)果見圖 1。

由圖 1 結(jié)果可知， 在1/2MS培養(yǎng)基上添加不同濃度的6-BA和NAA，對(duì)白芨原球莖誘導(dǎo)作用明顯不同。培養(yǎng)22d后，由圖1-A、1-D、1-G、1-J看出，添加單一植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA 對(duì)原球莖生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，并且隨著NAA濃度的增加，原球莖顆粒狀變大，但是較高濃度的NAA不利于原球莖的分化；而單一添加6-BA對(duì)原球莖的生長(zhǎng)影響較小(圖1-B和1-C)； NAA和6-BA配合使用有利于原球莖的誘導(dǎo)，添加1.5 mg/L 6-BA 和 1.0 mg/L NAA，誘導(dǎo)出的原球莖顆粒狀大，長(zhǎng)勢(shì)好(圖1-L)；研究還發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)原球莖生長(zhǎng)的過程中，在原球莖的表面觀察到大量透明的毛狀物，張燕等[8]研究推測(cè)這些毛狀物為原球莖表皮發(fā)生的表皮毛，與幼根根毛是同功的，是行使吸收水分和養(yǎng)分的“假根”，由圖1-A、1-D、1-G、1-J看出，添加適當(dāng)濃度的NAA明顯促進(jìn)了毛狀物的發(fā)生，這可能與原球莖的生長(zhǎng)及分化存在緊密聯(lián)系。綜合分析白芨種子誘導(dǎo)的原球莖大小和生長(zhǎng)情況，最適宜白芨種子原球莖誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為1/2MS+ 1.5 mg/L 6-BA + 1.0 mg/L NAA。

圖1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方對(duì)白芨原球莖誘導(dǎo)的影響Fig.1 Effects of different hormone formulas on B.striata protocorm induction

2.2 不同NAA和6-BA質(zhì)量濃度組合對(duì)白芨原球莖分化的影響

以MS 為基本培養(yǎng)基，添加NAA與6-BA進(jìn)行不同質(zhì)量濃度組合試驗(yàn)，研究影響白芨原球莖分化的因素，結(jié)果見表1和圖2。

從表1可以看出，激素NAA和6-BA的配合使用，可以不同程度上增加分化芽數(shù)，有效促進(jìn)原球莖的分化，但不同配比對(duì)白芨原球莖芽的增殖效果不同。在9種組合處理中，6-BA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L， NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L，原球莖的新芽增殖率最高，增殖倍數(shù)達(dá)6.6±0.9，并且原球莖呈綠色，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，分化的叢生芽葉片大，芽增殖效果最好(圖 2-A)；同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)添加50.0 g/L土豆泥和香蕉泥均不利于原球莖新芽的增殖，但有利于原球莖芽苗的生長(zhǎng)(圖 2-B、I)，其中6-BA 質(zhì)量濃度為 0.5 mg/L， NAA 質(zhì)量濃度為 0.3 mg/L，并添加土豆泥時(shí)原球莖分化最快，幼苗長(zhǎng)勢(shì)最好(圖2-B)。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，白芨原球莖芽增殖的適宜培養(yǎng)基為 MS+0.5mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，適合白芨原球莖分化的培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA +50.0 g/L土豆泥。

表1 不同配方對(duì)白芨原球莖增殖與分化的影響1Tab.1 Effects of different medium formulas on B.striata protocorm proliferation and regeneration

注1：不同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05)。

圖2 不同培養(yǎng)基配方對(duì)白芨原球莖生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of different medium formulas on B.striata protocorm growth

2.3 NAA對(duì)白芨芽苗生根的影響

待白芨幼苗生長(zhǎng)至2～3 cm高時(shí)，切下芽苗，接入不同處理的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)芽苗生根，生長(zhǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)生根情況，結(jié)果如表2所示。

組培苗的生根情況直接影響移栽的成活率，根系生長(zhǎng)旺盛有利于馴化移栽。從表3可以看出，在不添加NAA的培養(yǎng)基中，瓶苗生根率可達(dá)到80 %，但根系生長(zhǎng)狀況差，生根數(shù)最少，根長(zhǎng)最短，且根較細(xì)；添加適當(dāng)濃度的 NAA 有利于白芨生根，質(zhì)量濃度在 0.5～1.0 mg/L 時(shí)，生根率均達(dá)100 %(表3)，且NAA 質(zhì)量濃度為0.5 mg/L，平均生根數(shù)最多，可達(dá)(10.4±1.34)條。因此結(jié)合前面的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加香蕉泥不但促進(jìn)芽苗生根，而且幼苗的長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)。根據(jù)以上結(jié)果，最佳生根培養(yǎng)基配方為 1/2 MS+0.5 mg/L NAA+70.0 g/L香蕉泥。

表2 NAA對(duì)白芨苗生根影響1Tab.2 Effects of NAA on seedling rooting

注1：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

表3 不同基質(zhì)對(duì)白芨試管苗移栽成活率的影響Tab.3 Effects of different matrix on survival ratio of tube-seedlings transplanting of B.striata

2.4 白芨組培苗馴化移栽

白芨喜濕潤(rùn)，怕積水，移栽時(shí)基質(zhì)的透氣性和保濕性直接影響白芨苗的成活情況，同時(shí)考慮到節(jié)約成本，可選用當(dāng)?shù)厝菀椎茫瑑r(jià)格低的材質(zhì)，基質(zhì)配方為黃土∶蛭石∶珍珠巖∶草炭按體積比2∶3∶3∶2的均勻混合或黃土∶腐植土∶鋸木粉按體積比4∶4∶2，攪拌均勻混合，白芨幼苗移栽成活率均在96 %以上(表3)。

移栽時(shí)，挖穴深度可根據(jù)白芨苗根的長(zhǎng)度而定，使根舒展開即可，覆土厚度以剛好覆蓋住塊莖為宜，不需要壓實(shí)。移栽后小苗需要的光照較弱，需要適當(dāng)遮蔭，并保持通風(fēng)。移栽2周后可適當(dāng)增加光照，1個(gè)月后移栽幼苗已長(zhǎng)出新根，待小苗成活后，再移栽至大田種植。

3 討論

白芨種子的無菌萌發(fā)已成為其大規(guī)模種植重要的育苗方式[8-9,11,13]。由于白芨種子數(shù)目多，生產(chǎn)上較傾向于選擇原球莖直接誘導(dǎo)分化成苗的過程[14]。但在原球莖誘導(dǎo)、分化和生根培養(yǎng)過程中，合適的激素種類和質(zhì)量濃度配比至關(guān)重要。

在白芨原球莖誘導(dǎo)方面的研究，管常東等[15]研究發(fā)現(xiàn)，白芨原球莖誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；本研究得到的結(jié)果不同，適宜白芨原球莖誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方為1/2MS+ 1.5 mg/L 6-BA + 1.0 mg/L NAA，培養(yǎng)約45 d后，原球莖大，葉片深綠，葉大，苗壯，長(zhǎng)勢(shì)旺盛。很多研究者認(rèn)為在白芨種子的萌發(fā)階段，以1/2MS 為基本培養(yǎng)基，選擇植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA 和NAA，并按照一定配比，種子萌發(fā)情況最佳[11]，本研究得到的結(jié)果也印證了這一點(diǎn)，添加較低濃度的NAA，可以促進(jìn)種子萌發(fā)和原球莖的生長(zhǎng)，但達(dá)到1.0 mg/L濃度，會(huì)抑制幼苗生長(zhǎng)，當(dāng)同時(shí)加入1.5 mg/L 6-BA時(shí)，反而使幼苗生長(zhǎng)旺盛。因此，組織培養(yǎng)過程中選擇合適的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類、濃度及配比對(duì)組織的產(chǎn)生和生長(zhǎng)至關(guān)重要。

在原球莖的芽增殖與分化研究方面，楊舒婷等[16]研究發(fā)現(xiàn)，白芨球莖在3 mg /L 6 -BA +0.1 mg /L NAA和 0.3 mg /L TDZ +0.1 mg /L NAA培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率最高，增殖芽數(shù)目最多，增殖率高；張燕等[8]研究得到的結(jié)論是最佳原球莖的增殖配方是1/2MS+ 0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，增殖倍數(shù)為2.1；劉敏等認(rèn)為添加土豆泥、椰子汁、香蕉泥等附加物有利于原球莖的增殖，最佳的增殖培養(yǎng)基配方為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+50.0 g/L土豆泥，并且增殖倍數(shù)達(dá)5.270；本研究得出的結(jié)論不同，原球莖的芽增殖的適宜培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，與之前的研究相比，明顯提高了原球莖新芽的增殖倍數(shù)，平均增殖倍數(shù)達(dá)到6.6；添加50.0 g/L土豆泥和香蕉泥均不利于原球莖的新芽增殖，但明顯促進(jìn)原球莖的分化和芽苗的生長(zhǎng)，適宜原球莖分化培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA +50.0 g/L土豆泥。

在1/2MS基本培養(yǎng)基上添加合適的NAA，對(duì)白芨幼苗生長(zhǎng)和根系發(fā)育起到?jīng)Q定作用，添加土豆泥[17]、香蕉泥[18]、番茄汁[13]等能促進(jìn)白芨無根苗的生根和壯苗。本研究發(fā)現(xiàn)白芨的壯苗生根培養(yǎng)基以1/2MS+ 0.5 mg/L NAA +70.0 g/L 香蕉泥的效果顯著，與文獻(xiàn)[13]、文獻(xiàn)[18]的研究結(jié)果一致。

本研究得到白芨原球莖高效再生技術(shù)體系為：將白芨種子播于1/2MS+ 1.5 mg/L 6-BA + 1.0 mg/L NAA培養(yǎng)基上進(jìn)行原球莖的誘導(dǎo)；然后接入培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA進(jìn)行原球莖芽的增殖，或直接接入MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA +50.0 g/L土豆泥培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)；最后進(jìn)行生根培養(yǎng)，配方為1/2 MS+0.5 mg/L NAA+70.0 g/L香蕉泥，將無菌組培苗移栽至以黃土∶蛭石∶珍珠巖∶草炭按體積比 2∶3∶3∶2均勻混合或黃土∶腐植土∶鋸木粉按體積比4∶4∶2攪拌均勻的基質(zhì)中，使白芨組培苗逐步轉(zhuǎn)向大田種植。優(yōu)化的白芨原球莖高效再生體系可以在白芨育苗產(chǎn)業(yè)化發(fā)展中推廣應(yīng)用。