運用數據挖掘和網絡藥理學探討肝衰竭用藥規律及機制分析

呂建林,柳琳琳,張文富,王光耀,胡振斌,毛德文*

(1.廣西中醫藥大學第一附屬醫院， 廣西南寧530023; 2.廣西中醫藥大學， 廣西南寧530001)

肝衰竭(liver failure，LF)是臨床常見的多種因素形成的肝功能嚴重障礙性疾病，具有極高病死率[1]。由于形成LF病因較多，如肝炎病毒、藥物(肝毒性物質)、膽道疾病及代謝異常等多因素均可引起LF，一旦發病即出現一系列如黃疸、腹水、肝性腦病等臨床癥候群，現代醫學對LF的治療多為對癥治療，尚未有特效藥物[2]。根據LF癥狀體征，多屬中醫急黃、臌脹及黃疸等范疇。隨著各代中醫家對LF的病因認識與治療，逐步形成解毒化瘀、補陽祛瘀解毒、清熱祛濕解毒等治法[3-5]。因此運用現代技術挖掘現有各代中醫家治療LF的文獻資料，得出治療LF的用藥規律，同時結合網絡藥理學從微觀層面分析所得組方用藥核心藥團的作用機制，有助于發現中醫處方藥物配伍的潛在機制，以期為LF的臨床及實驗研究作出貢獻。

1 數據與方法

1.1 數據(處方)來源

以“肝衰竭”、“中醫治療”、“中藥治療”、“中醫藥治療”、“中醫”、“中藥”、“中醫藥”、“liver failure”, “LF”,“traditional Chinese medicine treatment”, “traditional Chinese medicine”, “traditional Chinese medicine”, “traditional Chinese medicine”等為主題詞，檢索PubMed、Embase、Cochrane Library、中國知網(CNKI)、中國生物醫學文獻數據庫(CBM)、萬方(WanFang)和維普(VIP)數據庫所有與肝衰竭相關的文獻。

1.2 納入標準

運用中藥處方治療LF的臨床研究，明確提供中醫大家配伍用藥經驗及全部中藥處方組成的期刊文獻。

1.3 排除標準

排除基礎研究及非臨床研究，排除中西醫結合治療LF的臨床研究，排除重復中藥處方及無具體中藥處方的期刊文獻。

1.4 數據處理

經篩選后得154篇期刊文獻，154劑/張臨床中藥處方數據，參考《中藥大辭典》和《中藥學》(十二五教材)對所得處方用藥名稱、功能分類進行統一規范整理，遵循客觀原則進行信息提取，將所得數據使用 Excel軟件建立“肝衰竭(LF)處方用藥”數據庫，通過二分類變量形式錄入處方用藥信息，為確保處方用藥信息錄入準確無誤，數據的錄入以數據員1及數據員2交叉核對的形式進行。

1.5 數據分析

1.5.1 數據挖掘分析

運用Excel軟件對數據進行頻數統計；SPSS Modeler對數據進行關聯規則分析，獲得治療肝衰竭(LF)核心藥團；SPSS Statistics對數據進行因子分析。

1.5.2 網絡藥理分析

在TCMSP、 SymMap、TCM-ID數據庫平臺檢索肝衰竭(LF)核心藥團的所有化學成分，根據口服生物利用度(oralbioavailability，OB)≥30 %及類藥性(drug—likeness，DL)≥0.18的藥物篩選標準選取藥物活性成分；通過Pharmmapper數據庫篩除重復靶點，并將肝衰竭(LF)核心藥團的化合物潛在靶點上傳至UniProt數據庫中篩選物種為“Homo sapiens”的靶點作為核心藥團作用于肝衰竭(LF)的有效作用靶點；將所得肝衰竭(LF)核心藥團潛在靶點信息上傳STRING獲得蛋白互作網絡圖；根據STRING數據庫上所獲得的數據導入Cytoscape 軟件進行可視化分析，并行拓撲學網絡分析和評估節點在全網絡中的重要程度；篩選TTD、Genecards數據庫綜合得出肝衰竭(LF)相關靶點，利用Venn分析工具，將兩者與肝衰竭(LF)核心藥團潛在靶點進行比對分析；篩選David數據庫，對核心藥團對肝衰竭(LF)的作用靶點進行GO及KEGG分析，且利用“富集因子=目標基因集中屬于該通路的基因數量/背景基因集中該通路所有基因的數量”計算出富集因子，最后繪制氣泡圖。

2 數據挖掘方面

2.1 用藥頻次統計

將所納入期刊文獻中154首臨床處方的全部中藥按降序排列，共有186種中藥，累計出現8 040次。在154首臨床處方中，使用頻次≥20次的中藥共有20種，累計頻率3 060次，包含有清熱藥(兼涼血、解毒、燥濕、瀉火)6味，利濕藥(兼退黃、消腫)5味，補氣藥3味，活血化瘀藥2味，溫里藥1味，瀉下藥1味，解表藥1味，開竅藥1味。使用頻次最多的前10味中藥分別是茵陳(119次)、赤芍(94次)、大黃(87次)、梔子(59次)、丹參(59次)、茯苓(57次)、白術(51次)、郁金(42次)、甘草(42次)及虎杖(38次)。使用頻次≥20次的中藥見表1。

表1 中藥用藥頻次1Tab.1 Frequency of Chinese medicine

注1：頻次≥20次。

2.2 高頻中藥關聯分析

高頻中藥關聯通過SPSS Modeler軟件運用Aprioi算法對高頻中藥(頻次≥20次)進行關聯分析，設置前項數為5，最低條件支持度為10 %，最小規則置信度為100 %，共得到10個高頻中藥組合，其中支持度最高的肝衰竭(LF)核心藥團(13.725 %)是茵陳→白術→大黃，所得高頻中藥組合的提升度均>1 %，均具有統計學意義。高頻中藥關聯組合見表2，高頻中藥間關聯網絡見圖1。

表2 高頻中藥關聯分析Tab.2 Analysis of association rules of high frequency Chinese medicine

圖1 高頻中藥間關聯網絡
Fig.1 Association network display between high frequency Chinese medicine

2.3 高頻中藥因子分析

對高頻中藥(頻次≥20)運用SPSS Statistic進行因子分析，統計得出KMO量數為0.538，巴特利特檢驗中，P=0.000，提示因子分析可行。取初始值大于1的成分共有8個，因子累計貢獻率為64.546 %，顯示該因子分析結果可包涵大部分信息，使用全體旋轉法得出旋轉矩陣成分圖(圖2)。將中藥歸于因子貢獻率最高的公因子中，可得8個公因子，具體見表3。

圖2 因子分析成分圖Fig.2 Factor analysis composition diagram

表3 高頻中藥因子分析信息表Tab.3 High frequency Chinese medicine factor analysis information table

3 網絡藥理方面

3.1 LF核心藥團化學成分

檢索TCMSP、 SymMap、TCM-ID數據庫獲取LF核心藥團(茵陳→白術→大黃)化學成分，共獲取200個化合物，其中茵陳53個、白術55個、大黃92個。根據口服利用度(OB≥30 %)及藥物相似性(DL≥0.18)篩選得出茵陳13個、白術7個、大黃16個。化合物包含有蘆薈大黃素(aloe-emodin)、毛細血管素(capillarisin)、異鼠李素(isorhamnetin)等，LF核心藥團各個有效成分的OB、DL值見表4。

表4 LF核心藥團化學成分1Tab.4 LF core drug group chemical composition table

注1：根據OB值降序排列。A：茵陳；B：白術；C：大黃。

3.2 LF核心藥團化學成分潛在靶點及相互作用

根據匹配度將獲得的潛在靶點進行降序排列，選取LF核心藥團化學成分的前十個蛋白進行下一步研究，共得350個。剔除相同的靶點后，最終得到102個靶點。包括PTGS2、HSP90AA1、DPP4、NCOA2、PTGS1等靶點。其中網絡度數值越大，提示核心藥團通過該靶點治療LF的可能性越大，具體參數見表5，靶點相互作用關系圖見圖 3。

圖3 核心藥團蛋白互作網絡圖Fig.3 Protein interaction network diagram of core drug group

表5 核心藥團化學成分化學成分—作用靶點參數Tab.5 Chemical composition-target parameters of core pellets

3.3 LF相關靶點數據構建及比對分析

圖4 核心藥團作用靶點與LF靶點的韋恩圖Fig.4 Venn diagram of core drug group target and LF target

查詢TTD數據庫，獲得6個經實驗及臨床試驗的藥物治療性靶點，其中有0個與核心藥團的潛在靶點重合；初步篩選Genecards數據庫得出1 438個候選基因，依據“Relevance score”度取相關度最高的前300個結果，與核心藥團(茵陳→白術→大黃)靶點重合的有20個。通過合并數據庫法查詢后，共篩選出305個LF高度相關性靶點，與核心藥團(茵陳→白術→大黃)有20個重疊靶點，所得韋恩圖見圖4。

3.4 核心藥團主要活性成分對LF作用靶點的生物信息學分析

通過David數據庫進行GO分析，富集出28個生物學過程，其中包含一氧化氮生物合成過程的正調控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、膠原分解代謝過程(collagen catabolic process)、細胞外基質拆卸(extracellular matrix disassembly)、蛋白激酶B信號轉導的正調控(positive regulation of protein kinase B signaling)等。4個細胞組成，其中包括細胞外空間(extracellular space)、細胞外區域(extracellular region)、蛋白質性細胞外基質(proteinaceous extracellular matrix)、細胞外基質(extracellular matrix)等。以及12個分子功能，絲氨酸型內肽酶活性(serine-type endopeptidase activity)、酶結合(enzyme binding)、咖啡因氧化酶活性(caffeine oxidase activity)、金屬內肽酶活性(metalloendopeptidase activity)等。具體相關分類見圖5。

圖5 核心藥團對LF作用靶點的GO分析結果Fig.5 Results of GO analysis of core drug group on LF target

進行KEGG分析可得到11條信號通路，其中包含有TNF信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路及FoxO信號通路，KEGG分析結果見表6；利用“富集因子=目標基因集中屬于該通路的基因數量/背景基因集中該通路所有基因的數量”計算出富集因子，并繪制氣泡圖，見圖6。

表6 核心藥團對LF作用靶點的KEGG分析結果Tab.6 Results of KEGG analysis of Core drug group on LF target

圖6 核心藥團對LF作用靶點KEGG分析的氣泡圖
Fig.6 Bubble map of KEGG analysis of targets of core drug group on liver failure

4 討論

數據挖掘方面，處方用藥統計后顯示，治療肝衰竭(LF)的高頻用藥以清熱藥和利濕藥為主，輔以活血化瘀藥、補氣藥及瀉下藥。清熱藥以“清泄里熱”為主功效，其中不少清熱藥功效廣泛，同時有瀉火、涼血和解毒的作用。利濕藥以“滲泄水濕、通利水道”為主，根據各類藥物功效可分為利濕退黃、通淋和利水消腫三類。提示對LF的臨床用藥，可注重選用清熱藥及利濕藥，如清熱瀉火，兼涼血、解毒及清利濕熱的梔子；以利濕為主，兼可退黃、清熱解毒的茵陳、虎杖；具有利水滲濕，兼有健脾作用的茯苓。隨證輔以郁金活血涼血利膽退黃，白術補氣健脾燥濕利尿，大黃清泄濕熱瀉火解毒等活血化瘀、補虛、瀉下等藥物。這也符合清熱利濕為主，兼化瘀解毒的中醫治療法則。

高頻中藥關聯分析發現，關聯強度的最高的高頻中藥組合有10個，置信度均為100 %，提示10個LF高頻中藥組合預測準確程度可信。其中支持度最高的LF核心藥團是茵陳→白術→大黃，余為茵陳→金錢草、茵陳→白花蛇舌草、茵陳→金錢草→大黃、茵陳→郁金→丹參→大黃、茵陳→白花蛇舌草→赤芍、茵陳→柴胡→大黃、茵陳→虎杖→郁金、大黃→郁金→梔子→赤芍、茵陳→郁金→丹參→大黃→赤芍。由此得出，對于LF的臨床用藥需注重利濕藥—補虛藥—瀉下藥及利濕藥—清熱藥—活血化瘀藥—瀉下藥的配伍應用，提示此配伍可作為LF臨床研究的未來研究方向。

高頻中藥因子分析得出8個公因子，F1梔子、大黃、金錢草、黃芩(清熱—瀉下—利濕—清熱)；F2黃芪、柴胡、赤芍、丹參(補虛—解表—活血化瘀—活血化瘀)；F3虎杖、郁金(利濕—活血化瘀)；F4石菖蒲、白花蛇舌草(開竅—清熱)；F5茯苓、澤瀉(利濕—利濕)；F6牡丹皮、生地黃(清熱—清熱)；F7附子、茵陳、白術(溫陽—利濕—利濕)；F8甘草(補虛)。可見清熱藥及利濕藥在中醫藥治療LF中發揮著重要作用，且注重清熱藥、利濕藥與活血化瘀藥、補虛藥的搭配應用。

網絡藥理方面，篩選LF核心藥團(茵陳→白術→大黃)后發現部分化合物對肝衰竭具有重要的作用。如蘆薈大黃素(aloe-emodin)、毛細血管素(capillarisin)、異鼠李素(isorhamnetin)等。經研究驗證，蘆薈大黃素具有抗HBV病毒作用，藥效與拉米夫定相當，而且蘆薈大黃素具有激活CYP3A4的特性，可增強抗HBV的療效[6]。實驗研究表明，毛細血管通過至少兩種不同的途徑對大鼠原代肝細胞中t-BHP誘導的細胞毒性和遺傳毒性具有抑制作用[7]。亦有研究[8]發現毛細血管素在保護肝功能方面具有強保護作用。實驗結果[9]顯示毛細血管素可抑制脂多糖(LPS)所誘導產生的TNF-α、IL-6、IL-1β、NO及PGE2，且能抑制LPS誘導的TLR4表達及NF-κB和MAPKs的活化，即毛細血管素可抑制LPS誘導的炎癥。經實驗[10]發現異鼠李素可抑制肝星狀細胞(HSC)活化，減少細胞外基質(ECM)的形成和自噬，能顯著抑制肝纖維化。同時研究表明異鼠李素在肝纖維化和肝纖維化模型中均具有抗纖維化活性[11]。LF核心藥團的化合物靶點網絡中，起重要作用的靶點有PTGS2、HSP90AA1、DPP4、PTGS1等。這些靶點與抗肝纖維化[12、13]、保護肝功能[13]等過程有關，且部分存在著協同作用。

分析LF核心藥團靶點網絡時發現核心藥團中存在多個與保護肝功能、抗肝炎病毒、抗肝纖維化相關的重要靶點。為此對LF核心藥團作用于LF的作用靶點進行進一步的GO功能及KEGG通路分析。GO功能分析中發現LF核心藥團對一氧化氮生物合成過程的正調控、膠原分解代謝過程、細胞外基質拆卸的作用。在KEGG道路分析中發現TNF信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路及FoxO信號通路等信號通路所含基因大致相似，如IL6、MAPK14、IL1B等，各信號通路通過研究表明與LF相關。實驗結果顯示BAPTA-AM脂質體(BAL)在急性肝衰竭(ALF)小鼠模型中可逆轉形態變化并調節TNF-α和NF-κB表達，降低巨噬細胞中LPS刺激的炎癥反應，從而有效治療肝衰竭[14]。研究發現[15]負調節NOD樣受體3(NLRP3)表達的負調節因子microRNA-223在慢性肝損傷及其他肝臟疾病中起重要作用，且發現miR-223的類似物miR-2233p可下調急性肝炎的炎癥因子IL6和IL12以及趨化因子Ccl2，Ccl3，Cxcl1和Cxcl2的轉錄表達，在慢性肝損傷中可顯著緩解纖維化發展和肝星狀細胞(HSC)活化，提示負調控NOD樣受體信號通路可用于治療急慢性肝損傷性疾病。GTE可通過降低內毒素-TLR4(Toll樣受體4)-NFκB(核因子kappa-B)的炎癥來緩解非酒精性脂肪性肝炎(NASH)[16]。

本研究運用現代技術挖掘中醫藥治療LF的臨床數據，從而得出治療LF的處方用藥規律及LF核心藥團。進一步運用網絡藥理學從微觀層面初探LF核心藥團治療LF的相關潛在靶點、復雜生物學過程和通路機制，以期為后續涵括LF核心藥團新處方的有效成分及作用機制提供前期理論基礎，更好地論述LF中藥成方應用的科學性，給臨床用藥提供理論支持。