基于電化學(xué)還原氧化石墨烯的電化學(xué)DNA生物傳感器

朱濟(jì)鋒, 黎學(xué)思, 周大明, 于樂泳, 王國東, Chaker Tlili

(1.河南理工大學(xué) 電氣工程與自動化學(xué)院,河南 焦作 454150；2.河南理工大學(xué) 物理與電子信息學(xué)院,河南 焦作 454150；3.中國科學(xué)院 重慶綠色智能技術(shù)研究院精準(zhǔn)醫(yī)療單分子診斷中心,重慶 400700)

0 引 言

隨著基因時代的來臨,進(jìn)行基因診斷已經(jīng)逐漸成為分子生物學(xué)和生物技術(shù)的重要領(lǐng)域,發(fā)展快速、敏感、經(jīng)濟(jì)、有效的臨床檢測脫氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid,DNA)傳感裝置需求越來越高[1]。在過去的幾十年里,各種技術(shù),如表面等離子體共振DNA生物傳感器[2],壓電DNA生物傳感器[3],和比色測定都在向檢測特異性DNA方面發(fā)展[4]。然而,這些方法檢測過程耗時、標(biāo)記步驟復(fù)雜、昂貴的成本使其無法在臨床檢測當(dāng)中展開應(yīng)用。相比之下,電化學(xué)生物傳感器是公認(rèn)的有前景的快速檢測裝置,如靈敏度、選擇性、檢測極限的提高,低成本和裝置的小型化。然而,傳統(tǒng)的電極表面探針的可固定量有限,所以,電化學(xué)DNA生物傳感器的靈敏度通常受到限制。

由于石墨烯突出的電特性,與傳統(tǒng)的電極相比擁有顯著提高的電導(dǎo)率、穩(wěn)定的電壓范圍和生物相容性,石墨烯成為最有潛力的發(fā)展下一代電化學(xué)生物傳感器的材料[5]。目前,從過去的研究中可以知道:氧化石墨烯(graphene oxide,GO)和還原氧化石墨烯(reduced graphene oxide,rGO)可以通過芳香鍵、氫鍵、疏水作用、范德瓦爾力、π-π鍵吸附單鏈DNA,但是雜化過后的雙鏈DNA與石墨烯之間的作用力卻很小[6]。因此近年來,利用石墨烯修飾的電極來檢測DNA引起了廣泛的注意力。

本文使用還原氧化石墨烯制備一種簡單、快速和可重復(fù)方法構(gòu)建DNA生物傳感器,實驗結(jié)果表明傳感器性能優(yōu)越。

1 基本原理

使用線性掃描伏安法在修飾有半胱氨酸的金電極表面修飾一層穩(wěn)定的rGO薄膜,設(shè)計了一種快速、高效和環(huán)保的技術(shù)。為了檢測所制備的生物傳感器的性能,使用方波伏安法(square wave voltammetry,SWV)來檢測固定到rGO表面二茂鐵標(biāo)記的DNA(ferro cene-labeled DNA,Fc-DNA)探針信號。當(dāng)固定有Fc-DNA探針的電化學(xué)生物傳感器與DNA互補(bǔ)鏈在反應(yīng)溶液中雜化過后,石墨烯表面的探針與互補(bǔ)鏈雜化形成雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)減弱了DNA與石墨烯之間的吸附作用,從石墨烯表面脫落。因此,方波信號檢測到的峰電流將變小[7]。圖1表明了傳感器的制備過程:(A)半胱氨酸在金電極上自組裝反應(yīng);(B)氧化石墨被吸附在氨基基團(tuán)上;(C)電化學(xué)還原氧化石墨烯;(D)固定探Fc-DNA針;(E)捕獲目標(biāo)DNA;(F)雜化后的DNA雙鏈從石墨烯表面釋放。

圖1 生物傳感器原理

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

電化學(xué)實驗均采用三電極系統(tǒng)：工作電極為金電極(直徑為2.0mm),鉑絲為輔助電極,飽和Ag/AgCl作為參比電極。循環(huán)伏安(cyclic voltammetry,CV)法、線性掃描伏安(linear sweep voltammetry,LSV)法和SWV均使用CHI760E 電化學(xué)分析儀(上海辰華儀器有限公司)；拉曼光譜儀(invia Reflex,英國)；實驗中所設(shè)計的不同序列DNA均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,序列如下：探針:Fc-DNA(5′-Fc-CAC-AAA-TTC-GGT-TCT-ACA-GGG-TA-3′);完全互補(bǔ)鏈 :DNA (5′-TA-CCC-TGT-AGA-ACC-GAA-TTT-GTG-3′);完全不補(bǔ)鏈:DNA (5′-AT-AAT-CTC-GTG-TAT-ACC-AAA-TGT-3′)。

氧化石墨烯(2 mg/mL,購自XFNANO材料科技有限公司,南京)；半胱氨酸(Cysteine,購自Sigma-Aldrich,上海)；過氧化氫(H2O2)、濃硫酸(H2SO4)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、二水磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、氯化鈉(NaCl)、 鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)和亞鐵氰化鉀(K4Fe(CN)6)(均購自科試,成都)；無水乙醇(damas-beta,上海)；各種緩沖液如下： DNA探針固定溶液為Tris緩沖液(10 mM Tris-HCl,pH 7.4；150 mmol/L NaCl)；DNA雜化溶液為Tris緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.4；150 mmol/L NaCl；)；SWV的測試溶液為磷酸緩沖溶液(10 mmol/L PBS,pH 7.4)；循環(huán)伏安法的檢測溶液為探針溶液(5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-,10 mmol/L PB,pH 7.4;150 mmol/L NaCl)；超純水是由Molecular水凈化系統(tǒng)制備用于所有緩沖液制備。

2.2 金電極預(yù)處理

首先將金電極用砂紙打磨,然后分別使用1,0.3,0.5 μm的氧化鋁粉末對金電極進(jìn)行拋光,直到電極表面光滑如鏡,并分別使用超純水和乙醇超聲清洗殘留的氧化鋁。然后在食人魚溶液(V(H2SO4)︰V(H2O2) =7︰3。注意：強(qiáng)危險性化學(xué)品)中超聲清洗5 min后再用超純水超聲清洗。將清洗后的電極放入0.1 mol/L 硫酸溶液中使用電化學(xué)工作站在-0.2～2 V的電壓范圍內(nèi)以100 mV/s的速率連續(xù)掃描直到曲線穩(wěn)定。最后,使用超純水超聲清洗干凈,并用高純氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

2.3 傳感器的制備

將預(yù)處理過的金電極浸沒在準(zhǔn)備好的1 mmol/L的半胱氨酸(Cys)溶液中放置12 h形成自組裝單層膜。然后使用乙醇和超純水分別超聲清洗3次,每次5 min去除沒有穩(wěn)固結(jié)合的半胱氨酸分子,即得到Cys/Au[8]。之后將Cys/Au浸沒在0.1 mg/mL的氧化石墨烯分散液中靜置6h。將電極取出來使用清水沖洗過后形成GO/Cys/Au電極,在0.1 mol/L的氯化鈉溶液中用LSV在0～-1.2 V的范圍內(nèi)用100 mV/s的掃描速率來電化學(xué)還原氧化石墨烯。形成rGO/Cys/Au,將(10 μmol/L)10 μL 的Fc-DNA探針溶液滴到rGO/Cys/Au上4 h,使用10 mmol/L PBS沖洗3次電極,得到Fc-DNA探針修飾的電極Fc-DNA/rGO/Cys/Au。

2.4 傳感器的電化學(xué)測試和雜化反應(yīng)

電化學(xué)DNA生物傳感器的制備過程使用CV來表征,掃描速率為100 mV/s,掃描范圍是-0.2～0.6 V,在5 mmol/L的氧化還原探針[Fe(CN)6]3-/4-溶液中來檢測。將Fc-DNA/rGO/Cys/Au浸到200 μL的一定濃度的目標(biāo)DNA分析液中,在室溫條件下反應(yīng)40 min,用10 mmol/L PBS沖洗除去非特異性吸附的DNA。峰電流信號由SWV在10 mmol/L PBS(pH 7.4)中進(jìn)行,掃描范圍-0.2～0.6 V,脈沖幅度為50 mV,掃描頻率為25 Hz。

3 結(jié)果與討論

電化學(xué)[9]還原氧化石墨烯一般分為兩種[10,11]方法,兩種方法都是主要用于在導(dǎo)電基底上制備石墨烯薄膜。然而這些用于制備石墨烯的方法有一定的局限性。石墨烯的薄膜厚度和均勻性難以控制以及表面的石墨烯容易脫落,會影響電極本身的穩(wěn)定性和重復(fù)性。本文中通過氨基嫁接的方法連接石墨烯[12]。

3.1 電化學(xué)還原氧化石墨烯

如圖2所示,表示電化學(xué)制備rGO/Cys/Au電極只需要2個步驟。首先通過化學(xué)吸收的方法在金電極表面自組裝形成半胱氨酸單層膜。然后,浸沒在酸性的氧化石墨烯分散溶液中放置12 h,帶負(fù)電的氧化石墨烯和半胱氨酸上帶正電的氨基相互吸附形成GO/Cys/Au電極。使用線性掃描伏安法在0～-1.2 V之間電化學(xué)還原氧化石墨烯中的含氧官能團(tuán)羧基和羥基。和預(yù)料的一樣,在0～-1.2 V之間以100 mV/s的速率第一次掃描后在-1.05 V處出現(xiàn)了還原峰,這歸于氧化石墨烯表面的含氧官能團(tuán)電活性減少。在第二次線性掃描時還原峰完全消失,表示GO已經(jīng)完全被還原成為rGO。

圖2 還原氧化石墨烯過程的線性掃描伏安

3.2 循環(huán)伏安法表征修飾電極表面

在電化學(xué)檢測中，可逆的氧化還原探針[Fe(CN)6]3-/4-對電極表面化學(xué)反應(yīng)是十分敏感的,電極表面修飾過程的CV表征曲線在含有5 mmol/L的氧化還原探針[Fe(CN)6]3-/4-的溶液中來檢測。如圖3所示,rGO修飾過后的電極在探針溶液為5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-,10 mmol/L PB,pH 7.4;150 mmol/L NaCl。氧化還原探針[Fe(CN)6]3-/4-在裸金電極表面展現(xiàn)了可逆的行為,其峰電壓距是90 mV。金電極表面自組裝過半胱氨酸膜后,電流峰值略有增長,峰電壓距減小到80 mV。這個結(jié)果是由于半胱氨酸氨基上的正電荷與[Fe(CN)6]3-/4-還原探針的負(fù)電荷之間的靜電作用所導(dǎo)致的[8,13]。在電化學(xué)還原GO后電流峰值顯著增加,峰電壓間距增加。這是因為rGO的表面積大和優(yōu)良的導(dǎo)電性增加了電化學(xué)活性位點(diǎn)。

圖3 金電極修飾的不同階段循環(huán)伏安表征

3.3 拉曼表征[14]

GO和電化學(xué)rGO通過532 nm的激光來檢測。如圖4所示：可以觀察到兩個分別為D帶和G帶拉曼峰值在1 345 cm-1和1 600 cm-1。一般來說，D帶與石墨烯的結(jié)構(gòu)缺陷有關(guān),而G帶與sp2碳原子2維六角形晶格有關(guān)。 D帶與G帶的相對強(qiáng)度比(r=ID/IG)通常用來表征石墨烯的缺陷程度。氧化石墨烯的D帶與G帶的相對強(qiáng)度比ID/IG=0.99,電化學(xué)還原的氧化石墨烯的D帶與G帶的相對強(qiáng)度比ID/IG=1.58。由此可以推斷：在電化學(xué)rGO相對GO形成更多的sp2和結(jié)構(gòu)缺陷[14]。此外,電化學(xué)還原氧化石墨烯以后G帶從1 604 cm-1偏移到1 598 cm-1,這個在化學(xué)和熱還原氧化石墨烯中也被報道過。這些結(jié)論有效證實了氧化石墨烯的電化學(xué)還原過程。

圖4 氧化石墨和電化學(xué)還原過的還原氧化石墨烯的拉曼光譜

3.4 DNA傳感器的特異性

SWV作為一種非常靈敏的電化學(xué)技術(shù)用來分析電化學(xué)DNA生物傳感器的敏感性,在最佳條件下,使用制備的生物傳感器Fc-DNA/rGO/Cys/Au與不同濃度的目標(biāo)DNA反應(yīng),目標(biāo)DNA濃度范圍為1.0×10-13～1.0×10-6mol/L。可以觀察到：隨著目標(biāo)DNA濃度的增加,SWV的信號峰電流逐漸在減小。這可以解釋為：Fc-DNA探針與目標(biāo)DNA雜化形成雙鏈以后從還原氧化石墨烯表面解離,使電極表面的Fc-DNA探針減少,與之前報告的熒光和電化學(xué)阻抗譜方法一樣[15]。為了比較DNA生物傳感器和最小值的關(guān)系,將Fc-DNA探針產(chǎn)生的峰電流信號標(biāo)準(zhǔn)化,標(biāo)準(zhǔn)式ΔI(%) =[(IFc-DNA-IcDNA)/IFc-DNA] ×100,IFc-DNA和IcDNA分別是固定過Fc-DNA探針后的峰電流信號和探針與不同濃度目標(biāo)DNA濃度雜化反應(yīng)過后的峰電流,其峰電流值與目標(biāo)DNA濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系,所得線性回歸方程為線性回歸方程為：ΔI(%)=5.238log(CcDNA)-9.424,CcDNA為目標(biāo)DNA的濃度,線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.981。DNA生物傳感器檢測極限(limitation of detection,LoD)大約為2.0×10-13mol/L,比之前報道的DNA功能化的聚吡咯膜的檢測極限高了3個量級[16]。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為1.35 %,表示DNA傳感器的良好再生性。LoD是用一個等式估算,LoD=3SD/m,m為線性部分的斜率,SD為空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差量[17]。

3.5 DNA傳感器的選擇性

利用制備的DNA生物傳感器Fc-DNA/rGO/Cys/Au分別在最佳條件下與以下3種不同的溶液反應(yīng),不含DNA的陰極對照溶液(NC)、完全不互補(bǔ)的 DNA序列(nc-DNA)、完全互補(bǔ)的DNA序列(c-DNA)。在陰極對照溶液中未與目標(biāo)DNA反應(yīng)時,峰電流信號幾乎不變,標(biāo)準(zhǔn)差約為2.5 %±0.3 %。表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定性是因為Fc-DNA探針與氧化還原石墨烯之間很強(qiáng)的吸附力。為了驗證提出的選擇性,將Fc-DNA/rGO/Cys/Au與100 nmol/L的nc-DNA在最佳條件下反應(yīng),峰電流信號降低了12 %±0.4 %。然后將Fc-DNA/rGO/Cys/Au與100 nmol/L的c-DNA在相同條件下反應(yīng),像預(yù)期的一樣,峰電流信號相對nc-DNA的信號降低了3倍。表明了DNA生物傳感器良好的選擇性。

4 結(jié) 論

這種利用半胱氨酸在金電極上構(gòu)建rGO的電化學(xué)方法,可以制備快速、簡單、穩(wěn)定的基于rGO的電化學(xué)生物傳感器來檢測特異性DNA。通過對特異性DNA的檢測進(jìn)一步驗證了rGO在生物傳感器發(fā)展上的應(yīng)用。此外,設(shè)計的Fc-DNA探針通過π-π鍵吸附到還原氧化石墨烯表面,然后和完全互補(bǔ)鏈雜化后從石墨烯表面解離,使探針的固定和雜化過程得簡單、快速和方便。因此,這種構(gòu)建rGO的電化學(xué)方法是非常有前景的,在將來有望應(yīng)用到臨床快速檢測裝置上。