商 業， 白忠臣， 黎顯繼， 張正平

(1.貴州大學 大數據與信息工程學院，貴州 貴陽 550025;2.貴州大學 貴州省光電子技術及應用重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

0 引 言

光譜分析是現代醫學實驗和工業發展中的一個重要研究方向，與傳統的色譜分析[1]、質譜分析[2]和電化學分析[3]等相比，其具有操作方便、消耗試劑量小、重復性好、測量精度高和檢測速度快等優點，非常適合對低濃度的檢測物進行快速檢測。光譜分析可分為發射光譜分析和吸收光譜分析兩種。吸收光譜法在高精度檢測中是一種快捷、簡單并且成本較低的檢測方法，適用于蛋白質[4]、氨基酸[5]等生物分子和半導體材料[6]的檢測。如何提高吸收光譜靈敏度是近年來研究的熱點。目前已經研究出的幾種提高吸收光譜靈敏度的技術有光聲光譜技術[7]、腔增強光譜技術[8]、積分球技術[9]和衰減全反射紅外光譜技術[10]，但這些技術都需要相當復雜且昂貴的設備，以及專業的操作人員。因此，發展新型的低成本、高靈敏度的光譜技術是當前科學研究中的熱點。

傳統的吸收光譜法受吸收光程等因素的限制，難于進一步提高靈敏度和檢測限，限制了其在微小量樣品檢測中的廣泛應用。因此，提高吸收光程是吸收光譜技術的核心問題。多階散射增強吸收光譜法是一種簡單、可調節的光學檢測方法，適合測量濃度較低的被檢測物[11～13]。與傳統的吸收光譜技術相比，多階散射光譜法能夠提高光在被測樣品中的光程，進而提高檢測靈敏度、降低檢測噪聲，為微量樣品檢測提供了一種新的檢測方法。多階散射技術通過懸浮在含有需要檢測的樣品溶液中的微球使入射光經過被檢測樣品時發生多次散射，來延長光穿過被檢測樣品的光路長度。但該技術仍有著傳統吸收光譜法的優點:簡單、快捷且成本低。

本文通過在Cy3熒光染料水溶液中加入水相單分散的二氧化硅(SiO2)納米微球，使其充當隨機散射介質，從而實現光的多次散射，增加檢測光程長度，實現光譜吸收的增強。

1 實 驗

1.1 材 料

粒徑為200，400 nm的SiO2納米微球單分散液和表面含羧基的Cy3熒光探針試劑分別購自北京北達巨邦生物技術有限公司和南京拜恩特斯生物科技有限公司。分別取2，4，6，8，10，12 μL的不同粒徑的SiO2納米微球單分散液(0.05 mg/mL)裝入容量為4 mL的離心管中，再在每個離心管中加入20 μL的Cy3溶液(0.25 mg/mL)，加入去離子水定容至3 mL，配成水溶液。超聲分散2 min，使SiO2納米微球在含有Cy3熒光試劑的水溶液中均勻分散。

1.2 實驗裝置

實驗采用實驗室自行搭建的測量系統進行吸收光譜測量，激發光源 (鹵素燈光源)經過貼有三面平面鏡(鏡面朝內)的盛有待檢測溶液的石英比色皿中，由鏡面反射所收集到的光透過樣品，再經過兩面聚光透鏡由光纖耦合器傳給海洋光學的QE65000科研型光譜儀，最后由計算機進行數據采集與處理。測量系統結構如圖1所示。吸收光譜測量范圍為350～750 nm。以上所有測量均在室溫下進行。

所有被測樣品的吸收光譜都經過反復測量。為了消除光源和測量系統對被測樣品吸收光譜的影響，對所有被測樣品的吸收光譜均進行了歸一化處理。

圖1 吸收光譜測量系統結構示意

2 數據處理

采用差值法[14]來消除由于納米SiO2微球自身帶來的吸收貢獻。實驗將含有相同濃度納米SiO2微球的水溶液和Cy3熒光染料水溶液分為一組，對每組取差值，可得到Cy3熒光染料水溶液的吸收光譜信號

aCy3(λ)=aCb(λ)-ab(λ)

(1)

式中aCb(λ)為Cy3熒光染料水溶液與單分散SiO2微球混合水溶液的吸收光譜信號，ab(λ)為單分散SiO2微球水溶液的吸收光譜信號。aCy3(λ)排除了SiO2微球本身材料的干擾，是只取決于Cy3熒光染料原料本身的吸收特性的吸收光譜信號。

通過計算每組被檢測溶液的差值譜就可以排除散射介質自身所帶來的干擾，得到Cy3水溶液在不同濃度的SiO2微球作用下的吸收光譜。

3 結果與討論

當光線通過含有均勻的被測樣品的比色皿時，其光路是由盛樣品的比色皿決定。如果樣品分布不均勻，則通過的光經歷多次散射后在空間分布中表現出明顯的折射率變化。如圖2所示，在未加入SiO2微球前，Cy3溶液的檢測光路為l;而在向Cy3的溶液中加入SiO2微球后，由于SiO2微球對光進行了多次散射，使得檢測光路比原本的光路l更長，這樣就形成了多階散射增加光程的現象，從而提高了檢測的靈敏度。

根據朗伯—比爾定律[15]即式(2)來測量Cy3溶液的吸光度，A=-ln(I/I0)=αCl，其中，I0為入射光強，I為透射光強。當光被透明溶劑中溶解的物質所吸收時，吸收系數α、溶液的濃度C和光程l與吸光度A成正比。因此，采用增加光程l來提高吸光度A。

圖2 檢測光程及SiO2微球散射示意

本文中光程l的增加與入射光在被檢測溶液中通過無序介質SiO2微球的次數有關[11]。光程與入射光通過SiO2微球的平均自由路徑(lfree)的倒數成正比

l～1/lfree

(2)

平均自由路徑lfree由介質SiO2微球的濃度C、粒徑d和散射截面σsca決定的

(3)

式中F=πd3C/6，Qsca為單個SiO2微球的散射效率，g為平均散射角。

一般情況下，當微球尺寸遠小于入射光波長時，可采用瑞利散射描述散射光強與光波波長之間的關系;當微球尺寸與入射光波長相當時，則利用米氏散射進行描述[16,17]。本文使用的SiO2微球粒徑為200，400 nm，與可見—紫外光波長相近。因此根據米氏散射理論來處理SiO2微球與光的相互作用時的散射特性[18]，對不同半徑的SiO2微球在水中的散射效率進行分析，可以得到不同半徑的SiO2納米微球在水溶液中的散射效率Qsca，即Qsca=σsca/πa2，其中σsca為散射截面，a為SiO2納米微球的半徑。如圖3所示，在可見光的大部分范圍下SiO2微球有相對較高的散射效率(Qsca≈3.5)，在同一波長下，隨著SiO2微球半徑的增加，散射效率Qsca也在逐漸增加。

圖3 不同半徑的SiO2微球的米氏散射效率

圖4是由實驗室自行搭建的測量系統所測得的Cy3水溶液與純水歸一化后的吸收光譜，Cy3水溶液在517 nm和547 nm處各有兩個吸收峰，且547 nm處的吸收較高，這與文獻中關于Cy3在紫外可見光波段的吸收光譜的相一致[19]。在這里，基線是由裝有相同體積純水的比色皿測量所確定，可以看出，水沒有對Cy3水溶液的吸收帶來影響。

圖4 Cy3水溶液與純水歸一化吸收光

由實驗室自行搭建的測量系統測得的粒徑為200，400 nm不同濃度SiO2微球與相同濃度的Cy3水溶液混合的吸收光譜經過數據處理后的結果如圖5所示。

圖5 二種粒徑下的不同濃度SiO2微球與Cy3混合的吸收光譜

當粒徑一定時，隨著SiO2微球含量的增加，Cy3溶液的吸收強度都在逐步增強。這是由于SiO2微球起到了散射作用，SiO2微球濃度的增加，散射作用增強，檢測的光程l也逐漸增長，導致Cy3水溶液的吸收也增強了。當SiO2微球到達一定的濃度后，Cy3溶液的吸收不再增強，這是由于高濃度的SiO2微球容易產生聚集，會降低光程的增加，使得隨機介質的散射能力減弱。

由圖6可以看出，在取相同量SiO2微球單分散液的情況下，粒徑為400 nm的微球比粒徑為200 nm的微球對Cy3溶液的吸收增強效果更好。在粒徑為400 nm的SiO2微球單分散液與Cy3混合溶液中，SiO2單分散液為10 μL時，吸收強度取得最大值，約比不含SiO2微球的Cy3水溶液增強了1.82倍。在粒徑為200 nm的SiO2微球單分散液與Cy3混合溶液中，SiO2單分散液為8 μL時，吸收強度取得最大值，約比不含SiO2微球的Cy3水溶液增強了1.63倍。

圖6 在λ=547 nm處不同濃度、粒徑的SiO2單分散液與Cy3混合的吸收強度

根據式(3)、式(4)和參數F=πd3C/6可以得出，隨機介質SiO2微球的濃度C、粒徑d，決定了參數F的值，C和d越大，則F的值越大，隨機介質間的平均自由路徑lfree則會變小，形成多階散射狀態，光程l也隨之增加。但是F也有增加的上限，一旦超過這個界限，溶液的吸收不再繼續增強反而會降低。

4 結 論

研究發現，隨著SiO2微球濃度和粒徑的增加，其散射作用不斷增強，Cy3溶液中檢測的光程l也逐漸增長，被檢測的Cy3溶液的吸收明顯增強了1.82倍。該實驗結果具有潛在的實際應用價值，該方法比傳統的吸收光譜檢測具有更高的靈敏度和更低的檢測限度，為低濃度和短光程的樣品檢測提供了一種新的方法。