白露湯含藥血清對人肺癌A549細胞活力、凋亡及周期的影響

朱紫薇，周忠光，韓玉生

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

肺癌是全球范圍內患病率和死亡率最高的惡性腫瘤，也是人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[1]。肺癌有多種病理分型，其中非小細胞肺癌占肺癌總數的80%以上[2],肺腺癌占非小細胞肺癌的50%。從腫瘤細胞學方面來看，肺癌發生的本質在于細胞異常增殖與凋亡的調節失控有關[3]。中醫典籍中并無肺癌這一直接病名，但根據肺癌的臨床癥狀和體征，本病的相關論述散見于 “肺巖”“胸痛”“咯血”“息賁”“肺萎”“肺癰”等證的范疇。可見正氣不足在先，繼而痰、濕、氣、瘀、熱、毒搏結為患，本虛標實貫穿始終，故治療上以扶正祛邪為基本原則[4]。縱觀各醫家之論，治法多以扶正培本、解毒散結、化痰祛濕、活血化瘀為主。白露湯為自擬方劑，是在臨床治療肺癌過程中確立，療效確切，具有扶正解毒、清肺消腫的功效。方中靈芝[5]補氣、止咳、平喘，露蜂房散結解毒，白僵蠶化痰散結、止痙止痛，干蟾皮清熱解毒[6]、利水消腫[7]。四藥合奏顯現中藥的抗癌的優勢，可對肺癌細胞的增殖周期進行調控與誘導凋亡[8]。本研究觀察了白露湯含藥血清對人肺癌A549細胞活力、凋亡及生長周期的影響，現報告如下。

1 材料

1.1 細胞株培養

人肺腺癌細胞株A549購于武漢博士德生物工程有限公司。細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM的培養液中。培養環境為37℃，恒溫培養箱中通入5% CO2飽和濕度培養，2～3天進行一次換液傳代(用胰酶進行消化傳代)。

1.2 藥物

白露湯中靈芝、白僵蠶、露蜂房和干蟾皮4種藥物飲片均購于黑龍江省哈爾濱市醫藥藥材總公司，經黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院鑒定為正品。上述中藥飲片由黑龍江中醫藥大學實驗實訓中心制備，生藥含量為0.9 g/mL。

1.3 儀器

二氧化碳培養箱HF-90(上海力申)；多功能酶標儀M200PRO(瑞士TECAN 公司)；超速冷凍離心機H-2050R(湖南湘儀離心機儀器有限公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；電熱恒溫培養箱DH36001B(天津泰斯特)；倒置相差顯微鏡AE31(麥克奧迪)；電泳儀及垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司)。

1.4 試劑

胎牛血清(BI公司，美國，貨號04-001-1ACS)； RPMI1640培養液(Gibco公司，美國，貨號12100-46)； CCK8試劑盒(萬類生物公司，中國，批號WLA074b)；噻唑藍、蛋白酶抑制劑、順鉑(Sigma 公司，美國)；細胞凋亡溴化乙啶(EB)染色試劑盒(南京凱基)；Annexin V-PI細胞凋亡檢測試劑盒(上海晶美)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(萬類生物公司，中國)；RIPA裂解液， HIF-1α等抗體(萬類生物公司，中國)；β-肌動蛋白(β-actin) 兔單克隆抗體，抗 EGFR 兔單克隆抗體、HRP-羊抗兔 IgG 酶標二抗(全式金公司，中國北京)。

2 方法

2.1 細胞分組

將培養好的細胞隨機分為空白對照組，白露湯低、中、高劑量含藥血清組(簡稱低、中、高劑量組)，陽性藥組(即順鉑組)。做好標記，并分別加入對應的溶劑。

2.2 含藥血清的制備

給予大鼠灌服處理過的白露湯，按照25 mL/kg的劑量灌胃給藥，每天2次，連續7天。末次給藥前禁食12 h，于末次給藥1 h后，大鼠腹主動脈取血。室溫下靜置30 min，取上清液3 000 rpm離心15 min，于56℃水浴中滅活30 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜備用。

2.3 低、中、高含藥血清的配比

低劑量的含藥血清是藥物血清與正常DMEM培養基以1∶40體積配比；中劑量的含藥血清是藥物血清與正常DMEM培養基以1∶20體積配比；高劑量的含藥血清是藥物血清與正常DMEM培養基以1∶10體積配比。

2.4 CCK-8檢測

白露湯低、中、高劑量組，順鉑組與空白對照組含藥血清，用DMEM培養基稀釋，使含藥血清的體積分數達10%(V/V)[8-9]；將培養好的人肺腺癌A549細胞接種于96孔板，每孔100 μL，孵育培養24 h，待細胞貼壁后棄去原培養液，每孔加入配制好的不同組別的含藥血清各100 μL，每組平行設置5個復孔；置于孵箱內培養24 h，48 h，72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續培養4 h；然后置于酶標儀中檢測，在波長450 nm處測定吸光度值(OD)，每組重復3次,計算細胞活力(%)。

細胞活力=(實驗組OD-空白調零組OD)/(空白對照組OD-空白調零組OD)×100%

2.5 Western-blot檢測

顯微鏡下觀察白露湯作用24、48 h后的人肺腺癌A549細胞活性變化; 收集細胞，RIPA細胞裂解液裂解細胞，提取蛋白;采用BCA法測蛋白濃度;分別加入一抗Bax、Bcl-2、C-caspase和HIF-1α(1∶500)，于脫色搖床上孵育2 h，TBST液洗膜3次，加入HRP-羊抗兔IgG酶標二抗(1∶5 000)孵育1 h，TBST液洗膜3次，加入發光劑，去除多余液體，在暗室中用X膠片感光，顯影，定影;采用凝膠成像儀掃描膠片，用Image-Pro Plus軟件分析各條帶的灰度值，將各組Bax、Bcl-2、C-caspase、HIF-1α與其β-actin灰度值比值作為蛋白相對表達量。

2.6 流式細胞儀檢測

收集培養的細胞，藥物作用結束后，吸除培養液，PBS沖洗2次，細胞胰酶消化，離心，去上清，PBS清洗2次，加入PI染液，4℃室溫避光30 min后上機檢測，記錄紅色熒光值，每組重復操作3次。

2.7 統計學處理

3 結果

3.1 細胞活力的比較

經檢測顯示，空白對照組與各濃度含藥血清組的細胞存活率之間存在統計學差異(P<0.05)。白露湯各濃度給藥組與空白對照組在24 h、48 h、72 h后比較，人肺腺癌A549細胞活力逐步下降，差異有統計學意義(P<0.05)。但各濃度含藥血清組之間的差別無統計學意義(P>0.05)。結果表明，低、中、高劑量白露湯含藥血清在24 h、48 h、72 h均對A549細胞活力有抑制作用，并且含藥血清濃度越高抑制作用越強，隨著作用時間的延長抑制作用也逐漸增強。結果見圖1。

注：與空白對照組比較，＊P<0.05；與順鉑組比較，＊P<0.05。圖1 各組對A549細胞活力的影響

注：A：空白對照組；B：順鉑組；C：低劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組。圖2 Western blot檢測Bax、Bcl-2、C-caspase和HIF-1α蛋白表達

3.2 對A549細胞凋亡的影響

經計算低、中、高劑量組細胞凋亡率分別為41.9%、64.9%、73.1%，說明白露湯含藥血清各給藥組均可以不同程度增強誘導A549細胞凋亡。與空白對照組比較，各劑量組A549細胞中的Bax、Bcl-2、C-caspase和HIF-1α的蛋白表達均顯著變化(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達上調，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達明顯下調，Bcl-2/Bax的表達尤其顯著。各蛋白變化的趨勢與含藥血清藥物濃度有關。同時，差異有統計學意義。結果表明，白露湯含藥血清各濃度組均能誘導A549細胞凋亡，且隨藥物濃度的增加凋亡的數目隨之增加。結果見表1和圖2。

表1 白露湯含藥血清對A549細胞凋亡的影響

注：與空白對照組比較，＊P<0.05。

3.3 對A549細胞周期的影響

與空白對照組比較，白露湯中、高劑量組含藥血清作用24 h可影響A549細胞各周期的分布，G0/G1期細胞比例顯著提高(P<0.05)；S期細胞比例顯著降低(P<0.05)；G2/M期細胞比例降低，但無顯著性差異(P>0.05)。結果表明，白露湯能阻滯A549細胞周期于G0/G1期，且與劑量濃度正相關。結果見表2。

表2 白露湯含藥血清24 h對A549細胞周期的影響

注：與空白對照組比較，＊P<0.05。

4 討論

非小細胞肺癌5年的生存率低于15%，大部分以晚期為主[7]。肺癌晚期治療多以放、化療為主，但對患者可以產生不同程度的毒副作用。研究證實，腫瘤的發生與發展是細胞的異常增殖和調控失控導致的[10-11]。而抑制腫瘤細胞的增殖是治療腫瘤的關鍵途徑。誘導腫瘤細胞凋亡也是抗腫瘤的一種重要機制[12]。Bcl-2家族蛋白對細胞凋亡有調節作用，一類是Bcl-2為代表的抗凋亡蛋白，另一類是Bax為代表的促凋亡蛋白。所以，Bcl-2家族蛋白就是凋亡的關鍵靶點[13]。白露湯為清肺解毒藥，中藥復方的含藥血清是經過體內吸收代謝的產物，避免了中藥復方本身因制作工藝產生的干擾和非特異性理化因素對細胞作用的假陽性，可保證結果的真實性和可靠性。本研究結果表明，不同濃度的白露湯含藥血清對A549細胞的活力均有抑制作用，與藥物濃度、藥物作用時間相關；白露湯含藥血清作用A549細胞的作用是多靶點、多環節、多效應、多途徑的。各濃度含藥血清作用A549的24 h后，可顯著影響Bcl-2家族蛋白的表達，同時含藥血清中、高劑量組的G2/M期細胞比例也明顯阻滯[14]。綜上所述，本試驗的研究發現，白露湯可抑制人肺癌A549細胞的活力、影響其細胞周期、主動誘導腫瘤細胞凋亡。并且中醫藥治療不易產生耐藥性，可調節增強肺癌患者的免疫情況，對肺癌的治療綜合效果良好，但具體的抗腫瘤機制以及抗腫瘤作用的物質基礎將在后續繼續研究。