自噬在腫瘤上皮-間充質轉化以及侵襲轉移中的作用

童 行，何衛陽

(重慶醫科大學附屬第一醫院泌尿外科，重慶 400016)

在真核生物的生長發育中，自噬是一重要環節，其對于維持細胞穩定有著重要意義。根據底物的降解途徑不同，自噬可分為大自噬、小自噬、分子伴侶介導自噬。通常細胞會有一定水平但活性較低的基礎自噬，在一些應激因素(饑餓、缺氧、炎癥、藥物)刺激下，細胞的自噬活性可明顯增加。自噬過程發生異常，細胞在很多方面，如能量代謝、侵襲轉移等方面也會發生異常。研究表明EMT是腫瘤細胞侵襲轉移的重要機制之一，但目前自噬對上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影響以及具體機制還不清晰，有待進一步總結探討。故本文就自噬在腫瘤細胞EMT以及侵襲轉移機制中的作用進行綜述。

1 自噬分類

根據底物的降解途徑不同，自噬可分為大自噬、小自噬、分子伴侶介導自噬。

1.1 大自噬相對于其他兩種自噬途徑，大自噬的研究較為深入。自噬體的形成是大自噬的鑒別特征。在應激因素(饑餓、缺氧、炎癥、藥物等)刺激下，內質網來源的雙層膜形成，其向外周伸展，該過程即為自噬前體的形成。自噬前體進一步伸展包裹降解底物(可溶蛋白、細胞器等)，該過程即為自噬體的形成。最后，自噬體與溶酶體結合形成自噬溶酶體，進而降解底物為細胞生存提供所需物質[1]。

1.2 小自噬在哺乳動物中，小自噬研究較少。膜的直接形變包裹底物是其鑒別特征。小自噬可分為非選擇性小自噬、選擇性小自噬和內體小自噬。非選擇性小自噬表現為非特異性底物直接刺激膜發生內凹，底物進一步從內凹處吸收降解。特定的底物(線粒體、細胞核等)降解是選擇性小自噬的主要特點，特定底物先與膜伸出的凸起結合形成內陷小泡，進一步被吸收降解。細胞內多泡體的形成是內體小自噬的主要特征，其和降解底物的循環相關。降解底物通過多泡體、溶酶體被降解[2]。

1.3 分子伴侶介導自噬分子伴侶介導自噬是底物蛋白被分子伴侶識別后運送至溶酶體內降解的過程，沒有小泡參與底物降解是分子伴侶介導自噬的鑒別特征。首先，熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)和熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)、熱休克蛋白40(heat shock protein 40，HSP40)等輔助分子選擇性識別底物蛋白中的特定氨基酸序列KFERQ，與之結合形成復合物，并使底物蛋白去折疊。該復合物通過溶酶體相關膜蛋白2A(lysosome associated membrane protein，LAMP2A)被轉運至溶酶體內進行降解[3]。已有研究表明，LAMP2A與分子伴侶介導自噬的激活程度正相關，LAMP2A高表達，則分子伴侶介導自噬的激活程度高[4]。所以LAMP2A被認為是分子伴侶介導自噬的關鍵調控蛋白。

2 EMT與侵襲轉移

EMT主要分為3個類型，Ⅰ型與胚胎的發育、器官的形成有關，Ⅱ型與組織再生、器官發育有關，Ⅲ型和腫瘤發生進展有關[5]。原始部位的腫瘤細胞發生Ⅲ型EMT，腫瘤細胞的上皮細胞特性慢慢開始喪失，細胞之間的粘附作用進一步降低，這是EMT侵襲轉移機制的關鍵步驟。然后，細胞從基底膜脫落，獲得間葉細胞特性，因而侵襲運動能力增加。這些具有侵襲運動能力的細胞最終將侵入血管轉移至遠處形成新的病灶[6]。盡管已有研究表明，不是所有上皮性腫瘤細胞都需要轉變至間充質細胞狀態來形成轉移灶[7-8]，但是EMT仍是細胞侵襲轉移機制的研究重點。

EMT表現為上皮細胞的特征消失，其相關蛋白E-鈣粘蛋白、細胞角蛋白、α-連環蛋白、β-連環蛋白表達下降；間充質細胞相關蛋白N-鈣粘蛋白、波形蛋白、纖連蛋白等表達上升[9]。這些特異標志物的變化也是實驗檢測EMT發生進展的基礎。

EMT通過多條信號途徑影響腫瘤細胞的侵襲轉移，比如轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號途徑、Wnt信號途徑、Notch信號途徑、Hedgehog信號途徑、整合素連接激酶(inte-grin-linked kinase，ILK)信號途徑等[10-12]。這些途徑之間也存在著相互聯系，協同上皮-間充質轉化的進展。

3 不同類型自噬對EMT的作用

3.1 大自噬對EMT的作用目前，大自噬對腫瘤細胞EMT的作用機制還不完全明確，在不同的細胞中，自噬通過不同的信號途徑對EMT發揮著重要的作用。

3.1.1大自噬對EMT的促進作用

3.1.1.1TGF-β 在腫瘤細胞生理、病理進程中，TGF-β是誘發EMT的重要的因子。外源重組的TGF-β細胞因子可以刺激許多腫瘤細胞系發生EMT[13-14]。一般認為TGF-β可以通過Smad、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)等途徑上調BECN1、自噬相關基因(autophagy-related gene，ATG) 5、7等從而上調自噬[15]。另外，我們研究團隊發現，在膀胱癌細胞株中，饑餓處理細胞6 h誘導的大自噬可促進TGF-β1分泌增加，TGF-β1作為配體與膜上的Ⅱ型受體結合，使Ⅰ型受體激活，進而使轉錄激活因子Smad 2、Smad3發生磷酸化，磷酸化后的Smad 2、Smad3可以與Smad4形成復合體進入細胞核內，調控靶基因表達，促進EMT進展，進一步促進膀胱癌細胞侵襲轉移能力(圖1)[16]。

圖1 饑餓誘導大自噬促進膀胱癌細胞株EMT進展

饑餓處理膀胱癌細胞株，誘導的大自噬可促進TGF-β1分泌增加，TGF-β1作為配體與膜上的Ⅱ型受體結合，使Ⅰ型受體激活，進而使轉錄激活因子Smad 2、Smad3發生磷酸化，磷酸化后的Smad 2、Smad3可以與Smad4形成復合體進入細胞核內，調控靶基因表達，促進EMT進展，進一步促進膀胱癌細胞侵襲轉移能力。

在頭頸部鱗狀細胞癌中，CHEN等[17]應用外源的重組TGF-β1細胞因子處理細胞，發現TGF-β1在誘發EMT增強細胞侵襲遷移能力的同時也誘導了自噬的發生，抑制自噬后，EMT也被抑制，細胞侵襲遷移減弱。說明了在頭頸鱗癌中，自噬對TGF-β1誘導的EMT正性調控。在肝癌細胞中，TGF-β2在誘導細胞發生EMT增強侵襲轉移的同時也能誘導自噬的發生，抑制自噬后，其對EMT的促進作用也受到了抑制。說明在肝癌細胞中，自噬對TGF-β2誘導的EMT正性調控，其機制可能與抑制自噬后導致細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平增加有關[18]。

3.1.1.2Notch信號途徑 Notch信號通路與細胞的增殖、分化、凋亡以及侵襲轉移等過程密切相關，也是EMT發生的重要途徑之一[19]。在非小細胞肺癌細胞株A549中，用無血清培養基饑餓處理細胞可誘導自噬發生的同時也明顯促進EMT的發生，并且細胞遷移能力增強。通過沉默Atg3抑制自噬后，其遷移能力下降，EMT相關標志物逆轉以及Notch、snail蛋白的表達明顯降低；說明自噬通過Notch/snail信號通路對EMT正性調控[20]。

3.1.1.3Hedgehog信號途徑 Hedgehog信號途徑主要參與胚胎細胞的生長分化，在胚胎發育過程中起著重要的調控作用。同時Hedgehog信號途徑同樣參與腫瘤的進展，其也是EMT發生的重要途徑之一[21]。有研究表明，在膀胱癌細胞中，辣椒素(capsaicinoids，CPS)可以通過誘導自噬激活Hedgehog信號途徑從而促進EMT的發生[22]。

3.1.1.4自噬通過其他途徑促進EMT 鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase1，SPHK1)是一種鞘氨醇代謝酶，可以通過多途徑影響腫瘤侵襲轉移能力，比如SPHK1通過促進表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EFGR)通路激活從而促進食管癌細胞侵襲轉移[23]；SPHK1通過促進PTK2/FAK通路激活促進結腸癌細胞侵襲轉移[24]。LIU等[25]發現，在肝癌細胞中，SPHK1誘導EMT增強侵襲轉移能力的同時也能誘導自噬發生。在過表達SPHK1增強侵襲遷移的同時應用3-甲基腺嘌呤、氯喹抑制自噬，EMT相關標志物逆轉且遷移侵襲能力降低。表明在肝細胞癌中，SPHK1誘導EMT發生與自噬相關，且自噬正性調控EMT，其具體機制與自噬促進上皮鈣黏蛋白基因1(cadherin1，CDH1)的降解密切相關。CDH1是上皮鈣黏蛋白編碼基因，其表達下降是EMT發生的基礎。胰腺癌細胞中，低氧在誘導自噬的同時促進EMT發生并增強細胞的遷移能力；應用3MA抑制自噬或干擾低氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)后，細胞遷移能力下降，EMT相關蛋白標志物逆轉。說明在胰腺癌細胞中，低氧通過HIF-1α誘導的自噬正性調控EMT[26]。乳腺癌相關成纖維細胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAFs)能促進乳腺癌細胞的侵襲、轉移，其部分是通過誘導自噬，促進EMT完成的[27]。在缺氧條件下，長鏈非編碼氨基甲酰磷酸合成酶1(long non-coding carbamoyl phosphate synthetase 1,lncRNA CPS1)可抑制結直腸癌細胞EMT與侵襲轉移，其可能是通過lncRNA CPS1抑制 HIF-1α，從而抑制缺氧誘導的自噬完成的[28]。其表明自噬正性調控結直腸癌EMT，lncRNA CPS1通過抑制自噬進而抑制了細胞的EMT進展。

3.1.2大自噬對上皮-間充質轉化的抑制作用

3.1.2.1Wnt信號途徑 前文提到EMT通過TGF-β、Notch、Hedgehog、Wnt等多條信號途徑影響腫瘤細胞的侵襲轉移，其中自噬可以正性調控TGF-β、Notch、Hedgehog信號途徑促進EMT進展。而對于Wnt信號途徑，有研究表明自噬對其則是負性調控來影響EMT。在結腸癌細胞中，雷帕霉素和饑餓處理誘導自噬后，Wnt信號通路的關鍵誘導因子Wnt3a表達下降，用3MA抑制自噬后，饑餓處理對Wnt3a的抑制作用得到逆轉，說明了自噬可以負性調節Wnt信號通路進而影響EMT[29]。

3.1.2.2P62蛋白 P62蛋白對于腫瘤的進展、炎癥反應以及一些代謝相關疾病都發揮重要調節作用，也是自噬降解的一種選擇性底物蛋白，可以起到接頭蛋白調節信號轉導的作用。有研究表明，在小鼠黑色素瘤細胞中，抑制自噬能促進EMT：敲除Atg3、Atg5、Atg9、Atg12抑制自噬后，P62表達增加，E-鈣黏蛋白表達下降，同時細胞侵襲轉移能力增強。這里自噬負性調控EMT與P62對TWIST1的正性調控有關，TWIST1是EMT的重要調控因子，具有抑制腫瘤細胞E-鈣黏蛋白的作用[30]。

3.1.2.3SNAIL轉錄因子 SNAIL轉錄因子和前文提到的TWIST1都是誘導EMT發生的關鍵性調控因子和始動因素。在膠質母細胞瘤中，饑餓處理或應用雷帕霉素后，自噬被誘導，細胞遷移侵襲能力下降，抑制自噬后其遷移侵襲能力上升。其具體機制與自噬對SNAIL的抑制有關，自噬被誘導后，抑制SNAIL表達，其對鈣黏蛋白的抑制解除，鈣黏蛋白表達增加，細胞進而獲得上皮樣表形[31]。

3.1.2.4BECN1對EMT的直接作用 BECN1是自噬的特異基因，是自噬的關鍵啟動因素。在乳腺癌細胞中發現死亡效應結構域DNA結合蛋白(death effector domain DNA-binging protein,DEDD)能直接與BECN1復合體結合，穩定磷酸肌醇-3-激酶3 (Phosphoinositide-3-Kinase Class 3，PIK3C3)，促進BECN1與PIK3C3的相互作用，誘導自噬發生，進而抑制EMT和細胞侵襲轉移[32]。

3.1.2.5自噬通過其他途徑抑制EMT 有學者認為，在腫瘤進展過程中細胞骨架與線粒體是自噬和EMT相互作用的橋梁。EMT的激活可使細胞骨架聚合和重塑，進而促進線粒體裂解進一步維持EMT和細胞遷移。但自噬的大量激活可誘導線粒體重建，導致游離線粒體減少，進而抑制細胞EMT進程和遷移[33]。

3.2 分子伴侶介導自噬對EMT的作用分子伴侶介導自噬和大自噬一樣，在一些應激因素刺激下，都會被誘導。已有研究表明分子伴侶介導自噬對于腫瘤的生存、進展起著重要作用。KON等[34]首先驗證了在多種腫瘤細胞株中，分子伴侶介導自噬具有高活性，然后在肺癌細胞株中，沉默分子伴侶介導自噬的限速蛋白LAMP2A后，分子伴侶介導自噬活性降低，腫瘤細胞的增殖、遷移能力也明顯下降。另外有研究發現，分子伴侶介導自噬活性的減弱會導致P65降解受損，而逐漸積累的P65會增加核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)的活性，進一步促進EMT的進展[35]。分子伴侶介導自噬對腫瘤細胞EMT的作用以及具體機制尚不完全明確，還有待進一步研究。

3.3 小自噬對EMT的作用相對于其他兩種類型自噬，小自噬的研究較為淺顯。特別是在哺乳動物的腫瘤細胞中，小自噬研究較少。目前關于小自噬的研究大多集中在其形態學方面，其對腫瘤細胞侵襲轉移作用以及其對EMT作用還有待進一步研究。

4 總結與展望

在早期階段，自噬通過誘導線粒體重塑并去除受損和有毒性物質來抑制腫瘤侵襲轉移。腫瘤進展到晚期，自噬又可通過協助腫瘤細胞應對外界刺激，獲得更頑強的生存能力以及更強的侵襲轉移能力。自噬可能以不同的分子機制在腫瘤上皮-間充質轉化侵襲轉移過程中發揮著“雙重作用”(圖2)。研究表明，自噬作為一種細胞自我保護機制，對許多腫瘤化療藥耐藥的形成至關重要，抑制這種保護性自噬后，藥物敏感性增加[36-37]。但是，在抑制自噬增強化療藥敏感性的同時，抑制自噬對腫瘤細胞上皮-間充質轉化以及侵襲轉移是否也是抑制作用？即靶向調控自噬，是否在多方面對腫瘤的治療起到協同作用，這還需要進一步的探討。

圖2 自噬以不同的分子機制對EMT的作用

現階段關于自噬對腫瘤細胞上皮-間充質轉化作用的研究還處于初步階段，分子伴侶介導自噬和小自噬對EMT以及侵襲轉移機制的研究并未深入。進一步探討不同腫瘤、不同誘導因素誘導的自噬對EMT的作用以及3種自噬功能的交互聯系，明確其關鍵調節點的信號通路，針對不同腫瘤靶向調控自噬，將有可能為個性化的抑制腫瘤侵襲轉移尋找新的思路。