尿斑蛋白Ⅲ在SD大鼠前列腺各葉的表達及意義

安凌悅，張 珩，羅光恒，田 野，孫兆林

(1.貴州醫科大學附屬人民醫院泌尿外科，貴州貴陽 550002；2.貴州省人民醫院泌尿外科，貴州貴陽 550000)

前列腺切除術后尿路感染發生率為3.9%～14.0%，尿道狹窄和膀胱攣縮的發生率為7.0%～10.0%，尿道灼熱及尿痛的發生率為6.9%～29.5%[1-2]。可見，前列腺切除術并發癥仍未得到較好的控制，究其重要原因是前列腺切除術后創面修復的機制仍不甚清楚。為揭示術后創面修復機制，減少前列腺切除術后并發癥，需明確術后修復創面的細胞來源及過程。傳統觀點認為，前列腺切除術后修復創面的細胞來源于膀胱頸的尿路上皮細胞爬行覆蓋[3]。本研究團隊前期發現，前列腺切除術后修復創面的細胞可能來源于術后殘余前列腺包膜或側葉前列腺導管內皮的尿路上皮細胞，其分布隨著導管尿道開口處向腺泡腔底部延伸而逐漸減少至消失[4-5]。前列腺部尿道和前列腺導管開口襯著尿路上皮，尿路上皮最外層的傘狀細胞是其主要功能細胞，可防止毒性物質滲入機體，發揮這一關鍵作用的結構蛋白是尿斑蛋白(uroplakin，UP)。UP是一類與尿路上皮分化密切相關的特異性糖蛋白，分為UPⅠa、UPⅠb、UPⅡ和UPⅢ。UPⅢ特異性表達于尿路上皮，在維持尿路上皮延展功能和防止有毒物質的滲透中有重要作用[6-7]。因此，UPⅢ不僅是尿路上皮的重要結構功能單位，還是研究尿路上皮的特異性標志物。作者前期通過流式細胞證實前列腺組織中存在UPⅢ陽性的細胞[5]。然而，UPⅢ在前列腺腹側葉和側葉導管內皮的具體表達情況尚不清楚。本文旨在對UPⅢ在老年雄性SD大鼠前列腺導管內皮中的表達進行定位量化研究，為進一步研究尿路上皮在前列腺切除術后尿道修復過程中的意義提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物18周齡老年雄性斯潑累格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠15只購于貴州醫科大學動物房(合格證號：SCXK，黔2012～0004)，體重599.96～700.04 g。將其隨機均分3組，其中一組HE染色和免疫組織化學染色(免疫組化)的5只大鼠體重633.01～700.02 g，二組蛋白質免疫印跡(Western blot，WB)檢測分析的5只大鼠體重621.04～691.71 g，三組實時定量熒光酶聯聚合反應(Real-time fluorescence quantitative enzyme chain polymerization，RT-PCR)檢測分析的SD大鼠體重600.01～685.42 g，組間體重無統計學差異(P<0.05)。

1.2 取材將15只SD大鼠予水合氯醛(0.5 mL/100 g)麻醉后仰臥位固定消毒，行下腹部正中切口至恥骨聯合，充分暴露盆腔臟器，可見SD大鼠的前列腺腹側葉(中央帶和移行帶)包饒并貼附于尿道，前列腺側葉(外周帶)貼附于膀胱兩側，完整取出膀胱、前列腺部尿道及前列腺，均行多聚甲醛固定。

1.3 HE染色取一組SD大鼠膀胱、前列腺部尿道及前列腺組織，按標準操作程序(SOP文件)行病理連續切片和HE染色鏡檢其尿路上皮細胞。

1.4 UPⅢ檢測

1.4.1免疫組化法 取尿路上皮細胞學檢測病理連續切片按SOP文件行免疫組化染色檢測UPⅢ，其中膀胱作為尿路上皮細胞UPⅢ陽性對照(下同)。

1.4.2WB法 取二組大鼠膀胱、前列腺腹側葉和側葉組織剪成細小的碎片，按SOP文件行WB法檢測UPⅢ。

1.4.3RT-PCR法 取三組SD大鼠膀胱、前列腺腹側葉和側葉組織分別提其總RNA，消除總RNA中DNA及DNasel后反轉錄制備cDNA，對其進行PCR擴增，擴增后檢測UPⅢ基因CT值。擴增體系如下：SYBR Green Mix 10Ml，上游引物F 5 moL，下游引物R 5 mol，cDNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。引物及序列如下： UPⅢ-F，GGAGTGGAGGCATGATTG；UPⅢ-R，CCAGGGTCTTGGGAACA；β-Actin-F，CGTTGACATCCGTAAAGAC；β-Actin-R，TAGGAGCCAGGGCAGTA。

1.5 統計學方法數據采用SPSS22.0軟件進行統計分析，多組計量資料比較服從正態分布方差齊的使用單因素方差分析，不服從正態分布或方差不齊的使用Kruskal-WallisH非參數檢驗，以P<0.05判定為有統計學意義。

2 結 果

2.1 HE染色結果膀胱和前列腺部尿道內可見典型、胞質均勻的尿路上皮三層細胞(傘狀細胞、中間細胞和基底細胞)，呈極性排列(圖1A、B)。前列腺腹側葉中開口于尿道的前列腺導管近端也可見尿路上皮，層數約2～3層，厚薄不均，該處的傘狀細胞未呈極性排列，中間細胞和基底細胞完整，細胞呈極性排列(圖1C)。尿路上皮三層細胞隨著前列腺導管向腺泡腔底部延伸，數量逐漸減少，細胞排列由極性轉變為非極性，直至轉化為單層極性排列的腺上皮細胞(圖1D、E)。前列腺側葉中未能切出完整的前列腺導管，未能觀察到其尿路上皮的特點。

圖1 SD大鼠膀胱、尿道和前列腺導管HE染色結果(HE，×100)

A/B：膀胱和尿道內可見尿路上皮典型傘狀細胞、中間細胞和基底細胞，呈極性排列；C：前列腺腹側葉中開口于尿道的前列腺導管近端也可見尿路上皮，其中傘狀細胞未呈極性排列，中間細胞和基底細胞呈極性排列；D/E：隨著前列腺導管向腺泡腔底部延伸，尿路上皮細胞數量逐漸減少直至轉化為腺上皮細胞。

2.2 UPⅢ檢測結果

2.2.1免疫組化檢測結果 UPⅢ在膀胱、前列腺部尿道和前列腺導管內均呈胞質陽性表達，其中膀胱表達最強，其次為前列腺部尿道，前列腺腹側葉中前列腺導管尿道開口處的表達最弱(圖2A、B、C)。前列腺導管開口處UPⅢ的陽性表達隨著導管尿道開口向腺泡腔底部延伸逐漸減弱，最終在前列腺導管腺泡腔底部呈陰性表達。前列腺側葉中因未切出導管，未觀察到前列腺導管內UPⅢ的表達情況(圖2D、E)。

圖2 SD大鼠膀胱、尿道和前列腺導管免疫組化結果(免疫組化，×100)

A/B:UPⅢ在膀胱和尿道呈胞質陽性表達；C：前列腺腹側葉中前列腺導管尿道開口處的UPⅢ同樣呈陽性表達；D/E：前列腺導管開口處的UPⅢ陽性表達隨著導管尿道開口向腺泡腔底部延伸逐漸減弱，最終在前列腺導管腺泡腔底部呈陰性表達。

2.2.2WB檢測結果 膀胱、前列腺腹側葉和側葉UPⅢ的表達量分別為2 277.20±95.90、1 665.00±78.36和27.40±10.29，各組織間表達存在差異，有統計學意義(F=1 314.250，P<0.001)，其中膀胱表達強于前列腺腹側葉，側葉最低(圖3)。

2.2.3RT-PCR檢測結果 膀胱、前列腺腹側葉和側葉中UPⅢ基因CT值的差異有統計學意義(H=6.618，P=0.037)，其中膀胱與前列腺腹側葉間的差異無統計學意義(P>0.05)，前列腺側葉UPⅢ基因表達顯著低于膀胱、前列腺腹側葉(均P<0.05,圖4、表1)。

圖3 SD大鼠膀胱、前列腺腹側葉和側葉WB蛋白定量結果

A:UPⅢ在膀胱內的蛋白表達量最高，前列腺腹側葉次之，前列腺側葉極低；B：膀胱、前列腺腹側葉和側葉中UPⅢ表達量比例分布。

表1 RT-PCR檢測膀胱、前列腺腹側葉和側葉中UPⅢ基因的表達情況比較[M(P25～P75)]

注：*與膀胱、前列腺腹側葉比較，均P<0.05。

圖4 SD大鼠膀胱、前列腺腹側葉和側葉RT-PCR基因定量結果

A:按膀胱、前列腺腹側葉和側葉順序檢測各組織中UPⅢ基因的定量電泳圖(三復孔)，膀胱和前列腺腹側葉中均能檢測到UPⅢ基因的表達，前列腺側葉UPⅢ基因表達低；B/C：UPⅢ基因檢測CT值擴增曲線和溶解曲線。

3 討 論

尿路上皮主要由三層細胞組成，他們由內到外分別是基底細胞、中間細胞和傘狀細胞，其中發揮主要尿路上皮屏障功能的是最外層的傘狀細胞，其頂膜面有微絨毛，具有增強細胞表面張力、影響細菌粘附和流體運輸等功能[8-9]。此外，90%的傘狀細胞表面覆蓋著獨特的不對稱單位膜(asymmetric unit membrane，AUM)，它使尿路上皮具有高達75 000 Ω/cm2的擴膜電阻，能夠有效阻礙尿液中有害物質滲入機體，形成血尿屏障的重要功能結構[6,10]。

AUM的主要蛋白成分是UP，UP 分為UPⅠa(27 ku)、UPⅠb(28 ku)、UPⅡ(15 ku)和UPⅢ(47 ku)，他們以二聚體的形式構成亞單位，每個亞單位由6個內環蛋白(UPⅠa和UPⅠb)和6個外環蛋白(UPⅡ和UPⅢ)構成，約1 000～3 000個左右的亞單位裝配成一個斑塊覆蓋傘細胞頂膜面形成AUM。UPⅢ在細胞內的部分遠遠超過它在細胞外的部分，這種內外不對稱的分布方式與其他類型UP共同形成AUM的分子基礎。UPⅢ可表達于尿路上皮組織或尿路上皮源性的原發腫瘤和轉移腫瘤[11]，它對尿路上皮具有高度特異性，而在除前列腺導管以外的前列腺組織內為陰性，因此，UPⅢ常被用于對尿路上皮的鑒定。

作者前期證實SD大鼠前列腺導管近端存在尿路上皮細胞[5]。本研究進一步發現，前列腺導管內UPⅢ的陽性表達和尿路上皮細胞的排列一致，隨著導管向腺泡腔底部延伸，UPⅢ的陽性表達逐漸減弱至陰性，而前列腺除導管外其他部位并未觀察到UPⅢ的陽性表達(圖1和2)。并在這一特點的基礎上，從蛋白及核酸水平檢測到前列腺各葉中UPⅢ的表達量，其中前列腺腹側葉的表達量明顯高于前列腺側葉(P<0.05)，該結果和免疫組化表達特點一致。原因可能是前列腺腹側葉貼附于尿道，其中部分前列腺導管開口于前列腺部尿道，導管開口處的內皮組織有機會接觸尿液，為適應尿液環境和防止尿液滲入前列腺組織，該處內皮組織形成尿路上皮，該現象屬于機體的適應。反之，前列腺側葉中的前列腺導管內皮幾乎不接觸尿液，UPⅢ表達量低。

前列腺組織內分布有許多粗細不等的前列腺導管，協助完成前列腺液的分泌與運輸。前列腺切除術后修復前列腺部尿道的種子細胞并不來源于膀胱頸的尿路上皮細胞爬行覆蓋，該種子細胞可能來源于前列腺切除術后殘余的前列腺導管內皮，它從前列腺導管內爬行至創面，形成島狀上皮細胞，逐漸連接成片修復創面[4,12]。研究表明，在遭到破壞的膀胱尿路上皮組織中，低表達UPⅠ和UPⅡ基因，高表達UPⅢ基因；UPⅢ基因的表達可能與尿路上皮的修復密切相關[13]。

本研究結果中，由于前列腺側葉的前列腺導管細小，病理切片難以切出完成導管，免疫組化僅觀察到UPⅢ在前列腺腹側葉靠近尿道的前列腺導管內皮呈陽性，前列腺側葉中未觀察到導管內表達情況，除導管外的前列腺組織均為陰性。然而，WB及RT-RCR不僅在靠近尿道的前列腺腹側葉中檢測到大量UPⅢ，還在遠離尿道的前列腺側葉中檢測到少量UPⅢ。該結果說明前列腺導管內皮表達UPⅢ，推測前列腺導管內存在尿路上皮細胞，即使是在前列腺側葉(外周帶)同樣可能存在少量散在分布于前列腺導管的島狀尿路上皮細胞。當前列腺切除術將大部分前列腺腹側葉(中央帶和移行帶)切除，即使較多表達尿路上皮細胞的前列腺導管缺失，少量殘存于前列腺側葉(外周帶)中表達UPⅢ陽性的尿路上皮細胞仍可作為修復創面的種子細胞，在前列腺切除術后尿液及局部微環境變化的刺激下從殘余前列腺側葉的導管和包膜爬出，發生離巢、遷移及增殖，參與前列腺切除術后前列腺部尿道的修復過程，最終形成有功能的尿路上皮。

綜上所述，在老年SD大鼠前列腺導管內皮存在一定量的UPⅢ，進一步說明前列腺導管內存在尿路上皮，其主要分布于前列腺腹側葉(中央帶)的前列腺導管內皮，少量島狀尿路上皮細胞可能散在分布于前列腺側葉(外周帶)，這部分尿路上皮細胞可能是前列腺切除術后修復創面的種子細胞，將為前列腺切除術后創面修復機制的研究奠定基礎。