凋亡蛋白抑制因子Livin在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

王曉華 張玉娟

子宮內(nèi)膜癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升。早期腫瘤患者經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化手術(shù)治療后預(yù)后較好，晚期或復(fù)發(fā)患者預(yù)后較差[1]。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的異常增殖和凋亡受阻密切相關(guān)[2]。凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)是一類(lèi)重要的抗細(xì)胞凋亡因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制凋亡蛋白酶(caspase)活性的作用。Livin是目前發(fā)現(xiàn)的IAPs家族中活性最強(qiáng)的抗凋亡因子。研究發(fā)現(xiàn)，Livin在膀胱癌[3]、腎癌[4]、前列腺癌[5]、胃癌[6]、肺癌[7]等多種惡性腫瘤組織中特異性高表達(dá)。Livin在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響目前尚不明確。本研究通過(guò)檢測(cè)Livin在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)，研究Livin在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，將Livin的小分子干擾RNA(Livin-siRNA)轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和HEC-1-A細(xì)胞，觀察靶向干擾Livin對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 選取承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科2015年3月—2016年10月手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜標(biāo)本共118例，其中子宮內(nèi)膜癌組織62例，非典型增生內(nèi)膜組織26例，正常子宮內(nèi)膜組織30例。標(biāo)本采集經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。其中子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前均未接受放射、化學(xué)治療和激素治療，均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，標(biāo)本離體后迅速放入液氮中保存，備行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2 細(xì)胞株和試劑 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和HEC-1-A細(xì)胞(承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究所凍存)。Livin-siRNA、Livin陰性對(duì)照(Livin-NC)序列(蘇州吉瑪公司)，F(xiàn)BS、PRMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，Lipofectamine 2000、熒光定量PCR試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，TRIzol(美國(guó)Ambion公司)，反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(聯(lián)科生物公司)，Transwell小室(美國(guó)Corning公司)，Matrigel基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司)。

1.3 主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，紫外分光光度儀(美國(guó)CKMAN Coulter公司)，熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，SORVALL Biofuge fresco冷凍離心機(jī)(德國(guó)Kendro Labrotary公司)，電腦三橫高壓電泳儀RDY-1000A(北京榮陽(yáng)經(jīng)典科技有限公司)。

1.4 熒光定量PCR檢測(cè)Livin mRNA表達(dá) 采用TRIzol法提取組織總RNA，應(yīng)用紫外分光光度儀鑒定其純度，以1 μL RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA(cDNA)第1條鏈，應(yīng)用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。目的基因Livin和管家基因GAPDH引物由大連寶生物公司設(shè)計(jì)合成。Livin正向引物為5’-ACG GAG CAT GCC AAG TGG T-3’，Livin反向引物為5’-CTG CAC ACT GTG GAC AAA GTC TCT-3’(擴(kuò)增片段78 bp)；GAPDH正向引物為5’-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3’，GAPDH反向引物為5’-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3’(擴(kuò)增片段138 bp)。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min共40個(gè)循環(huán)。每樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將液氮中凍存的Ishikawa和HEC-1-A細(xì)胞復(fù)蘇，常規(guī)培養(yǎng)在含10%FBS的PRMI 1640培養(yǎng)基中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為ISK-I組和HEC-I組(均轉(zhuǎn)染Livin-siRNA)、ISK-NC組和HEC-NC組(均轉(zhuǎn)染Livin-NC)、ISK-B組和HEC-B組(均僅以10%FBS培養(yǎng)細(xì)胞)。按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)配制轉(zhuǎn)染試劑，采用脂質(zhì)體法將Livin-siRNA和Livin-NC序列瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Ishikawa和HEC-1-A細(xì)胞。

1.6 Western印跡檢測(cè)Livin蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h，收集各組蛋白質(zhì)，采用BCA法蛋白質(zhì)定量后，取40 μg進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。以封閉液封閉2 h，一抗(1∶1 000)于4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1∶3 000)孵育1 h。ECL發(fā)光液顯影后應(yīng)用天能6100圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行成像和定量分析，計(jì)算目的蛋白質(zhì)Livin/內(nèi)參蛋白質(zhì)β-actin的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.7 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力 侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel基質(zhì)膠與PRMI 1640培養(yǎng)基按1∶8比例混勻，每個(gè)小室以100 μL混合液均勻包被小室基底膜。收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，PRMI 1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL，每孔上室加入100 μL單細(xì)胞懸液，下室加入500 μL含20% FBS培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。擦凈Matrigel基質(zhì)膠和上室的細(xì)胞，甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色后取下微孔濾膜，樹(shù)膠封片。顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)6個(gè)視野細(xì)胞數(shù)量取其平均值，每組3個(gè)小室，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。遷移實(shí)驗(yàn)：小室不用鋪Matrigel基質(zhì)膠，在CO2培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)時(shí)間為36 h，其余操作同侵襲實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織臨床病理特征 62例子宮內(nèi)膜癌患者的平均年齡為(54.8±4.7)歲，其中年齡<60歲38例，≥60歲24例；肌層浸潤(rùn)深度<1/2 44例，≥1/2 18例；病理分級(jí)G1級(jí)46例，G2級(jí)10例，G3級(jí)6例；依據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2009年手術(shù)病理分期，Ⅰ或Ⅱ期54例，Ⅲ或Ⅳ期8例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例。

2.2 Livin mRNA在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá) Livin mRNA在子宮內(nèi)膜癌組織中的相對(duì)表達(dá)量(8.624±0.264)顯著高于非典型增生組織(3.497±0.186)和正常內(nèi)膜組織(1.000±0.098，P值均<0.05)。

2.3 Livin表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系 Livin mRNA在年齡<60歲與≥60歲的患者中的相對(duì)表達(dá)量分別為8.314±0.156和8.336±0.117，在肌層浸潤(rùn)深度<1/2與≥1/2的患者中的相對(duì)表達(dá)量分別為6.392±0.149、9.227±0.216，在病理分級(jí)為G1級(jí)與G2+G3級(jí)的患者中的相對(duì)表達(dá)量分別為7.068±0.103和9.392±0.125，在FIGO分期為Ⅰ或Ⅱ期與Ⅲ或Ⅳ期的患者中的相對(duì)表達(dá)量分別為8.296±0.214和8.913±0.207，在有或無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中的相對(duì)表達(dá)量分別為8.494±0.256和9.124±0.118。組間比較結(jié)果顯示，Livin mRNA僅在不同肌層浸潤(rùn)深度(t=7.325，P=0.016)和不同病理分級(jí)(t=5.578，P=0.027)的患者間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 轉(zhuǎn)染后Livin蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h，ISK-I組(0.395±0.012)和HEC-I組(0.514±0.022)的Livin蛋白相對(duì)表達(dá)量分別顯著低于ISK-NC組(1.108±0.048)、HEC-NC組(1.426±0.062)、ISK-B組(1.164±0.054)和HEC-B組(1.448±0.071，P值均<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.5 干擾Livin對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ISK-I組[(20.2±3.6)個(gè)]和HEC-I組[(28.8±3.2)個(gè)]的穿膜細(xì)胞數(shù)分別顯著少于ISK-NC組[(42.8±4.2)個(gè)]和HEC-NC組[(56.7±3.8)個(gè)，P值均<0.05]，見(jiàn)圖2。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ISK-I組[(22.5±2.2)個(gè)]和HEC-I組[(30.8±2.4)個(gè)]的穿膜細(xì)胞數(shù)分別顯著少于ISK-NC組[(52.8±3.6)個(gè)]和HEC-NC組[(58.9±4.5)個(gè)，P值均<0.05],見(jiàn)圖3。

1 ISK-B組 2 ISK-NC組 3 ISK-I組 4 HEC-B組 5 HEC-NC組 6 HEC-I組圖1 轉(zhuǎn)染后Livin蛋白表達(dá)的電泳圖

A ISK-NC組 B ISK-I組 C HEC-NC組 D HEC-I組圖2 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(0.1%結(jié)晶紫染色，×200)

A ISK-NC組 B ISK-I組 C HEC-NC組 D HEC-I組圖3 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果(0.1%結(jié)晶紫染色，×200)

3 討 論

Livin作為IAPs家族成員，在腫瘤發(fā)生、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、自然免疫等多方面發(fā)揮作用[8]。Chen等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，Livin在食管癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)。Liang等[10]應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Livin在59例胃癌組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示Livin的陽(yáng)性率為52.5%，且Livin的表達(dá)與肌層浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)。Wang等[11]通過(guò)研究Livin在結(jié)直腸腺癌、腺瘤和正常黏膜組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Livin在結(jié)直腸正常黏膜組織中不表達(dá)，而在腺瘤的隱窩、結(jié)直腸癌的癌變上皮中均有表達(dá)，提示Livin在結(jié)直腸癌的發(fā)生中起到一定作用。Ye等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，Livin在前列腺癌組織中高表達(dá)，并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞G1/S期促進(jìn)細(xì)胞增殖，推測(cè)Livin可能在前列腺癌的發(fā)生和細(xì)胞增殖方面起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Livin在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)上調(diào)，熒光定量PCR結(jié)果提示Livin表達(dá)與肌層浸潤(rùn)深度和病理分級(jí)有關(guān)，而與患者的年齡、FIGO分期和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。提示，Livin可能參與了子宮內(nèi)膜癌的惡性演進(jìn)過(guò)程，在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了一定作用。

腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致多種信號(hào)通路和通路上多基因激活狀態(tài)發(fā)生改變，從而使得腫瘤細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移的潛能[13]。張生軍等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，沉默Livin基因的表達(dá)可使胃癌SGC7901細(xì)胞體外侵襲和遷移能力明顯降低。Cho等[15]應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制Livin基因在肝癌HepG2細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞的侵襲和遷移能力顯著下降。Myung等[16]在研究Livin對(duì)大腸癌SW480和DK01兩種細(xì)胞生物學(xué)行為的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制Livin基因的表達(dá)，可顯著抑制兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力，而過(guò)表達(dá)Livin則可促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究采用脂質(zhì)體法將Livin-siRNA轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和HEC-1-A細(xì)胞，Transwell小室侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，轉(zhuǎn)染后兩種內(nèi)膜癌細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)均顯著減少，說(shuō)明干擾Livin表達(dá)可抑制Ishikawa和HEC-1-A細(xì)胞的侵襲和遷移能力，Livin在子宮內(nèi)膜癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了一定作用，與上述研究結(jié)果相符。

綜上所述，Livin在惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定作用，可將其作為腫瘤的預(yù)測(cè)因子進(jìn)行深入研究，但其預(yù)測(cè)價(jià)值尚需前瞻性、多中心研究的進(jìn)一步證實(shí)。