雞 飼 料 中 拉 沙 洛 西 鈉 的 測 定

■金夢銘 程林麗 陳可心 丁宇麗

（中國農業大學，北京100193）

拉沙洛西鈉（Lasalocid sodium）是由拉沙洛鏈霉菌(Streptomyces lasaliensis)產生的次級代謝產物拉沙洛西A 的鈉鹽。它是一種芳香聚醚類離子載體型抗生素類飼料添加劑[1]，根據我國農業部公告168 號規定，采用75～125 mg/kg拉沙洛西鈉混飼的方法用于治療雞球蟲病。但是，飼料中添加拉沙洛西鈉劑量過大時會對動物產生毒性作用[2]，長期或過量使用還會產生藥物殘留超標等問題。目前我國采取飼料中拉沙洛西鈉的測定——高效液相色譜法[3]作為檢測標準之一，但是由于該標準建立的年代過久，飼料樣品經提取后直接上樣分析基質干擾太大，靈敏度低，無法滿足現階段對飼料樣品監控的需要。因此，本研究對該飼料檢測方法標準進行改進，增加了樣品凈化的步驟并對其它各種條件進行了優化，建立了本檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和溶液

空白雞配合飼料、雞濃縮飼料和雞預混合飼料均由北京維德維康生物有限公司提供。拉沙洛西鈉標準品(Lasalocid，LAS：純度≥97%)購自Sigma公司。硅膠固相萃取柱（500 mg，6 ml），購自上海安普生物技術公司。正己烷-乙醚（50∶50，v/v）。二氯甲烷-甲醇（90∶10，v/v）、0.1%甲酸溶液、含0.1%甲酸的乙腈溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液（9∶1，v/v）、醋酸銨溶液（125 mmol/l）。1 000 μg/ml和100 μg/ml拉沙洛西鈉標準儲備溶液通過用甲醇配制或稀釋獲得。0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg/ml標準工作液通過用乙腈-0.1%甲酸溶液稀釋標準儲備液獲得。

1.2 液相色譜檢測方法

采用Waters 2695 高效液相色譜儀進行，配Waters 2475熒光發射檢測器。色譜柱為Shim-pack VPODS C18（4.6×250 mm，4.6 μm）色譜柱。流動相為乙腈-125 mmol/l 醋酸銨溶液（85∶15，v/v），等度洗脫。流速為1.0 ml/min。進樣量為20 μl。激發波長為314 nm。發射波長為418 nm。柱溫為室溫。

1.3 樣品前處理方法

稱取試樣2.00 g（精確到0.02 g）于50 ml離心管中，加10 ml甲醇，渦動1 min，振蕩提取40 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液。殘渣中加10 ml甲醇，重復提取一次，合并兩次提取液，定容至20 ml。取2 ml 提取液于40 ℃氮氣吹至近干，加5 ml 正己烷通過渦動溶解殘渣，為試樣溶液。取硅膠固相萃取柱，用5 ml正己烷活化，在正己烷液面即將進入柱床前，加入試樣溶液。用5 ml正己烷洗滌試樣溶液管，并將洗滌液全部通過固相萃取柱。再用8 ml正己烷-乙醚溶液淋洗小柱，最后用6 ml二氯甲烷-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，40 ℃氮氣吹干，加入乙腈-0.1%甲酸溶液1 ml，渦動1 min，過濾膜后供液相色譜分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線與線性回歸分析

各取20～1 000 μg/l 的系列濃度標準工作液相色譜分析。以藥物濃度為橫坐標，藥物峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果如圖1所示，在相應的濃度范圍內，藥物峰面積與濃度呈線性相關，線性回歸方程為y=614.3x+14 542，相關系數大于0.998。

圖1 拉沙洛西鈉標準曲線

2.2 方法的檢出限與定量限

取5個空白樣品在不加拉沙洛西鈉的基礎上按樣品前處理方法進行處理后上機檢測，按信噪比S/N=3為檢測限（LOD），S/N=10為定量限（LOQ）測定方法確定檢出限和定量限。結果如表1所示，飼料中拉沙洛西鈉的檢出限為3.57～11.83 μg/kg，定量限為11.90～39.43 μg/kg。

表1 飼料中拉沙洛西鈉測定的LOD和LOQ

2.3 方法回收率及變異系數

取2.00 g（精確至0.01 g）空白雞配合飼料、雞濃縮飼料，以1、10、20、50、100 mg/kg；雞預混合飼料以1、10、50、100、200 mg/kg 濃度水平進行五個濃度的添加回收試驗。每個濃度設5個平行，連續做3次，計算添加回收率、日內變異系數和日間變異系數(表2)，在四個濃度添加水平下，各種飼料中拉沙洛西鈉的平均回收率均滿足70%～120%；日內變異系數均小于15%，日間變異系數均小于20%，表明該方法回收率高，穩定性強，準確度、精密度和重復性均符合我國對飼料檢測方法的要求。三種飼料相關色譜見圖2～圖4，由圖可知，在拉沙洛西鈉保留時間位置無色譜峰干擾。

表2 飼料中拉沙洛西鈉添加回收率及變異系數

2.4 色譜分析

本方法采用Shim-pack VP-ODS C18（250 mm×4.6 μm）色譜柱分析，采用甲醇提取樣品，樣品提取液加水稀釋后通過硅膠固相萃取柱凈化，以乙腈-125 mmol/l醋酸銨為流動相進行等度洗脫分離。出峰時間在14.2 min左右。A為空白樣品，B為0.2 μg/ml拉沙洛西鈉標準溶液，C為混合拉沙洛西鈉的飼料空白樣品，在400 μg/kg的空白樣品添加回收試驗中，分別用配合飼料樣品、濃縮飼料樣品、預混合飼料樣品制備的空白樣品、添加拉沙洛西鈉標準溶液樣品和空白添加樣品進行測試，色譜圖見圖2～圖4。根據同種飼料和混合飼料的三種樣品的色譜圖，可以明顯看出在藥物的保留時間處無雜峰干擾，色譜峰明顯。

3 討論

圖2 配合飼料樣品色譜

圖3 濃縮飼料樣品色譜

圖4 預混合飼料樣品色譜

拉沙洛西鈉為中等極性的疏水性物質,可采用極性溶劑、稀酸或緩沖液提取，經離心后做進一步凈化。文獻報道的方法多采用乙腈、酸化乙腈、甲醇和酸化甲醇進行飼料樣品中拉沙洛西鈉的提取，也有少數方法采用弱堿性溶液提取[4-7]。這些檢測方法各有其特點，且方法論述詳盡，比較成熟。因此，實驗室對上述提取方法都進行了試驗，最后采用甲醇作為提取溶劑。為了提高提取效率，實驗室采用兩次提取法，且每次提取時采用渦旋使飼料與甲醇充分接觸后，接著震蕩提取，使目標藥物充分滲出。

從表1、表2的數據結果可以看出，本方法的回收率高、精密度好，可重復性強，同時符合經濟實用的要求。從圖2～圖4 的空白樣品和添加藥品樣品的色譜圖可以看出，色譜保留時間處均無任何雜峰干擾，說明各種雞飼料中的雜質對本文采取的測定方法無任何干擾。這說明本方法能夠滿足各種雞飼料中拉沙洛西鈉的測定。

4 結論

本研究建立了雞飼料拉沙洛西鈉測定的高效液相色譜法。在五個藥物添加濃度水平下，三種飼料中拉沙洛西鈉的平均回收率均滿足79%～89%；日內變異系數均小于12%，日間變異系數均小于12%。本方法準確、高效、靈敏，適用于對各種雞飼料中拉沙洛西鈉的測定。