虹鱒中草藥免疫增強劑體外快速篩選研究

■董春燕 姚 麗 邵 儉 安 苗 文 明 姜海波*

（1.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽550025；2.高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽550025；3.貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室，貴州貴陽550025）

虹鱒（Oncorhynchus mykiss）是我國重要的冷水性經濟魚類[1]。近年來，我國虹鱒的養殖發展迅猛，至2017 年養殖產量已達到4.146 萬噸[2]。然而病害頻發卻成為影響產業可持續發展的重要限制因素。以往普遍采用抗生素類藥物進行治療，不僅會造成較高的藥物殘留，降低水產品安全性，而且還會污染水體。因此，尋找安全的抗生素替代物，用于病害防治成為當前研究熱點。

中草藥具有高效、低毒、低殘留等優點，作為飼料在水產動物病害防治中具有廣闊的應用前景[3-4]。目前有科研人員用黃芪、肉叢蓉、川芎、金銀花、紅花、五味子、柴胡、魚腥草、白花蛇舌草、石斛、白術、白頭翁、絞股藍、桑螵蛸、甘草、板藍根、天麻等25味中草藥配成中藥方劑，開展了提升虹鱒免疫機能的研究探索，結果顯示實驗組和對照組血液樣品的免疫學指標差異顯著，表明中藥方劑具有提高免疫力的效果[5]。以茵陳、板藍根為復方一，紫草、金銀花為復方二研究發現，復方一比復方二更有效地提高虹鱒的抗氧化能力[6]。本實驗以虹鱒作為研究對象，來探討水浸提物對虹鱒外周血白細胞氧呼吸爆發活性和吞噬活性的影響。旨在初步篩選出能有效提高虹鱒免疫力和抗病能力的免疫增強劑，為虹鱒中草藥免疫增強劑的研發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用17 種中草藥購自貴陽市援生醫院，中草藥的中文名及拉丁文名如表1 所示。實驗用魚為貴州麗水生態農業有限公司大山三文魚養殖場提供，共十五條，其平均體重為1.5 kg左右。

1.2 實驗方法

1.2.1 中草藥的初步處理及中草藥濃縮提取液樣品的制備

從待用中草藥中各稱取30 g，分別放置于干燥烘箱中，設置成恒溫50 ℃烘烤24 h使其完全干燥；將各種中草藥用中草藥粉碎機進行粉碎后，用60目篩過篩并密封保存藥粉，于室溫干燥保存。17種中草藥各稱取2 g粉末放入100 ml燒杯中，后加入80 ml蒸餾水，煎煮至20 ml；靜置冷卻后去掉上清液體，再倒入蒸餾水80 ml，此方法重復三次；8 500 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm的無菌濾膜過濾，制成中草藥常溫濃縮提取液樣品備用。

表1 中草藥中文名及拉丁文名

1.2.2 虹鱒白細胞的準備

取3 尾虹鱒，用MS-222（200 mg/l）麻醉后，再用75%酒精棉球擦拭魚體，置超凈工作臺中的托盤上，尾靜脈采血。取血用注射器為含有0.3 ml肝素鈉（濃度：1 500 U 肝素鈉溶于1 ml PBS 中）的10 ml 一次性注射器。將所有血液混合，加入等體積的細胞培養基（L-15 IV）。另取10 ml離心管，加入1.5 ml梯度分離液，沿管壁緩慢加入3 ml 稀釋后的血液，使血液和細胞分離液有明顯的分離界面。室溫以2 000 r/min離心10 min；取中間層白細胞于新離心管內，加1 ml L-15 IV 輕輕混合均勻；取20 μl 細胞，加入等體積的0.2%盼藍，顯微鏡下數數得到細胞懸液初始濃度；用L-15 IV將其稀釋成2×107cell/ml 作氧負離子檢測；5×106cell/ml作吞噬活性檢測。

1.2.3 中草藥對外周血白細胞吞噬活性的影響

檢測中草藥對外周血白細胞吞噬活性的影響。將實驗分為中草藥添加組和對照組，取1.5 ml無菌離心管，加入100 μl白細胞懸液（5×106cell/ml），在中草藥組添加中草藥提取液樣品100 μl，對照組加PBS 100 μl，室溫孵育1 h；每管加入100 μl 的乳膠微球，輕輕混勻，室溫孵育1 h，吸去載玻片中的液體，加戊二醛100 μl，室溫固定5 min，吸去液體，加入Giemsa染色0.5 h，蒸餾水沖洗，自然晾干。在油鏡下分別取5個視野觀察計數，每種中草藥平行檢測3次，計算吞噬活性率（PA）和吞噬指數（PI）。

根據PA 和PI 測定結果，篩選能同時提高虹鱒吞噬活性的中草藥。

1.2.4 白細胞氧呼吸爆發活性的測定

取96 孔板，每一行為一組，每組又分A、B 2 個亞組，每個亞組3個孔，96孔板的第一行為對照組，其余各行為中草藥提取液樣品組。每孔加入5×106cell/ml白細胞懸液100 μl；中草藥樣品組的各孔再加入制備的中草藥提取液100 μl，對照組的各加入PBS 100 μl。室溫孵育2 h后，每孔吸去上清200 μl，用100 μl細胞培養液L-15 洗滌3 次；A 亞組各孔添加50 μl 細胞培養基L-15，B 亞組各孔添加細胞培養液L-15 和NBT各50 μl，再用PBS 將所有各孔補齊到200 μl。室溫孵育1 h 后，每孔吸去100 μl 上清，加100 ml 甲醇固定3 min，再吸去100 μl上清，用100 μl甲醇（70%）洗滌3 次。輕輕吸去各孔內的所有液體，室溫風干后，每孔加入2 mol/l KOH 100 μl 和DMSO 200 μl；用酶標儀測定各孔OD 630 nm 值，分別計算B 組氧呼吸爆發活性（SPO），B 組氧呼吸爆發活性提高率活性[NBTB（%）]。

2 結果

2.1 白細胞吞噬活性測定結果（見表2）

表2 不同中草藥對虹鱒外周血白細胞吞噬活性和吞噬指數的影響

由表2 可知，對照組吞噬活性（PA 值）達到（0.28±0.024）、吞噬指數（PI 值）為（1.31±0.04）。天麻組的吞噬指數（PI 值）低于對照組，表明天麻會抑制虹鱒外周血白細胞的吞噬活性；白芨、厚樸、麻黃、丹參、大黃、馬齒莧、澤瀉、黃柏、蒼耳子、貫眾、紅景天11 種中草藥添加組的吞噬活性（PA 值）顯著高于對照組（P＜0.05），蒲公英組的吞噬指數（PI 值）顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.2 氧呼吸爆發活性測定結果

對17種中草藥添加組進行白細胞氧呼吸爆發活性測定，實驗結果見表3：白頭翁、桂桔、白芨、大黃、貫眾、紅景天中草藥添加組的SPO 值顯著高于對照組；16種中草藥的NBTB（%）都大于15%。

表3 不同中草藥對虹鱒血白細胞呼吸爆發活性的影響

3 討論

本實驗發現大黃、白芨、紅景天和貫眾這4 種中草藥既可同時提高虹鱒外周血白細胞的氧呼吸爆發活性和吞噬活性。大黃在水產動物方面研究較多，有研究發現在草魚（Ctenopharyngodonidellus）飼料中添加大黃能顯著或極顯著增強草魚血細胞吞噬率和吞噬指數[5]；陳孝煊研究報道大黃可明顯提高異育銀鯽（Allogynogeneticcrucian carp）血液白細胞吞噬能力[7]；而吞噬活性作為魚類的一種免疫參數，白細胞吞噬能力的高低能直接反映出魚類非特異性免疫能力的大小，大黃提取物主要成分大黃素等能促進建鯉（Cyprinuscarpiovar. Jian）的生長，增強魚體的免疫力[8]。紅景天對小鼠外周血白細胞的吞噬能力有顯著提升作用[9]；紅景天能夠通過增加尼羅羅非魚（Oreochromisniloticus）血液中紅細胞體積、胞內血紅蛋白含量以及血細胞比容來改善其血液免疫系統，以此來提高其氧呼吸爆發活性[10]。王慶奎研究表明貫眾可提高斑點叉尾鮰血液白細胞吞噬率和吞噬指數，從而提高斑點叉尾鮰（IetalurusPunetaus）血液白細胞吞噬能力[11]；貫眾實驗組中哲羅鮭（Huchotaimen）各組織超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性有明顯的升高，其中以血細胞SOD活性提升最為顯著[12]；SOD是自由基損害的主要防御酶，可催化超氧陰離子自由基的歧化反應，從而阻斷自由基的連鎖反應，提高氧呼吸爆發活性。根據對虹鱒的氧呼吸爆發活性和吞噬活性的測定表明，在飼料中添加一定量的大黃、白芨、貫眾和紅景天可以提高虹鱒的非特異性免疫機能，但作用機理還有待更深入研究。

4 結論

在本試驗條件下，篩選出白芨、大黃、貫眾、紅景天4 種中草藥能夠顯著提高虹鱒外周血白細胞的氧呼吸爆發活性和吞噬活性，為虹鱒中草藥免疫增強劑組合方劑的設計提供了理論依據。