活性污泥飼料對刺參養殖水質、消化率、營養組分和消化酶的影響

■王路平 吳 垠 姜大為 趙 靜 李多慧 程 遠

（1.大連市現代農業生產發展服務中心大連市水產研究所，遼寧大連116085；2.大連匯新鈦設備開發有限公司，遼寧大連116039；3.近海（大連）生態發展有限公司，遼寧大連116085）

刺參（Apostichopus japonicus）自然分布于我國黃海、渤海海域，具有很高的營養價值[1]。遼寧是我國重要的刺參養殖主產區，2015 年全省刺參經濟產值達120 億元，約占漁業經濟總產值8.1%[2]。隨著刺參養殖產業的不斷發展，優質餌料的供應需求逐漸加大，刺參餌料的主要原材料為鼠尾藻、馬尾藻、大葉藻等大型海水藻類，但是近年來藻類資源量逐漸匱乏，很難滿足刺參餌料市場的需求。目前很多學者開展了刺參餌料和營養學的研究[3-5]，但是對刺參餌料原材料的開發還不夠深入。刺參一般生活在巖礁底的淺海，營底棲生活，有研究表明刺參可以利用其他動物的殘餌、糞便進行攝食[6-7]。活性污泥是室內工廠化大菱鲆養殖產生的代謝廢物和殘餌，通過生物包細菌降解處理的固體代謝物，含有一定量的粗蛋白質、粗脂肪和糖類等營養物質，可以滿足刺參生長的營養需要。目前還沒有刺參對活性污泥消化和吸收方面的研究。本實驗通過在海參商品飼料中添加不同比例的活性污泥，研究活性污泥對刺參養殖水質、營養物質的消化能力、體壁營養組分和腸道消化酶活力的影響，為提高養殖魚類污物的重復利用，開發適口性強、易于消化吸收的飼料原料提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 刺參來源及規格

實驗刺參取自大連金州三十里堡養殖場，平均體重為（0.97±0.09）g，挑選大小相似的健康個體進行分組實驗。

1.2 活性污泥來源和飼料設計

材料取自全封閉循環水養殖大菱鲆的生物包中固體代謝物，本實驗分別命名為污泥和活性污泥。污泥是在集污槽中直接收集的沒有經過生物處理的大菱鲆糞便和殘餌顆粒物等，活性污泥是大菱鲆養殖中的代謝物經過生物包中細菌降解處理后的脫落固體物。

實驗飼料配制的基本成分為海參商品飼料、污泥、活性污泥，按照污泥和活性污泥在飼料中所占比例設置實驗梯度。在實驗飼料中適量添加魚粉和沸石粉，使實驗組蛋白質和脂肪與對照組海參商品飼料營養成分盡量保持一致。實驗分為一個對照組和五個實驗組，每組設三個重復。A組為對照組，B組為污泥實驗組，C、D、E、F組為活性污泥實驗組。各組飼料的配比如表1。

表1 實驗飼料組成和營養水平（%）

根據以上各組飼料組成，我們將混合飼料涂在波紋板上投喂，并且適量添加粘合劑增加飼料附板的粘力。涂板投喂可以減少飼料在水中的溶失，便于研究海參的攝食情況。

1.3 日常管理及操作

養殖槽規格為50 cm×40 cm×80 cm，槽內弱充氣。海水取自大連黑石礁海域經過沙濾沉淀處理，槽內養殖水溫(14±1) ℃，pH 值7.9～8.4，鹽度30～32。每天早晨按照刺參體重的8%投放飼料板，投喂前清除糞便和殘餌并全量換水。養殖室內避光處理，白天光照小于600 Lx。

1.4 樣品測定與分析方法

1.4.1 水質指標

從投入飼料開始每隔3 h測刺參養殖槽內水樣的pH 值、溶解氧、氨氮、亞硝酸鹽指標，每隔6 h 測定活性磷酸鹽和化學耗氧量指標。溶解氧采用碘量法測定；pH值使用PHS-25型pH計測定；化學耗氧量采用堿性高錳酸鉀法測定；氨氮采用次溴酸鹽氧化法測定；亞硝酸鹽采用重氮偶氮比色法測定；活性磷酸鹽采用磷鉬藍比色法測定。

1.4.2 飼料消化率

60 d養殖實驗中每隔15 d記為一個周期，共四個周期。按飼料重量的0.5%加入三氧化二鉻，投喂飼料后采集糞便，分別測定飼料和糞便中Cr2O3的含量（SC/T 1089—2006）。

式中：B——飼料中Cr2O3的含量；

B′——糞便中Cr2O3的含量。

式中：B——飼料中Cr2O3的含量；

B′——糞便中Cr2O3的含量；

A——飼料中營養物質的含量；

A′——糞便中營養物質的含量。

1.4.3 刺參營養組分分析

在實驗第30 d和60 d從各組隨機取出刺參并立即解剖，去除體內石灰環、腸等器官，去離子水沖洗體壁后裝入干凈的聚乙烯干燥袋封口于-80 ℃低溫保存備用。水分含量采用105 ℃常溫加熱干燥法(GB/T 6435—1986)測定；灰分含量采用馬福爐焚燒法(GB/T 6438—1994)測定；粗蛋白質含量采用凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)測定；粗脂肪采用索氏抽提法(GB/T 6433—1994)測定；總糖含量采用硫酸-酚法測定。

1.4.4 腸組織粗酶提取液制備和活力測定

在實驗第30 d和60 d從各組隨機取出刺參，刺參停食72 h排空食物殘渣后，采集刺參腸組織，使用玻璃勻漿器在冰盤中研磨腸組織，并用磷酸鹽緩沖溶液稀釋10 倍制成勻漿液。將勻漿液在4 ℃下5 000 r/min離心20 min，取上清液作為粗酶提取液。

蛋白酶活力采用福林-酚法測定（國標QB/T 1803—93），在37 ℃下每分鐘水解酪素產生1 μg酪氨酸為一個酶活力單位；淀粉酶活力采用淀粉-碘顯色法測定，在37 ℃下30 min內100 ml酶液中的淀粉酶完全水解淀粉10 mg為一個酶活力單位；纖維素酶活力采用3，5-二硝基水楊酸法測定，在37 ℃下每分鐘催化纖維素水解生成1 μg葡萄糖的酶量為一個酶活力單位；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定，計算各組織酶比活力，即單位質量蛋白所含酶活力單位數。

1.4.5 數據計算及處理

數據均以“平均值±標準差”表示，用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析, 用Duncan′s多重比較法進行各組間平均值的差異顯著性比較,以P＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 飼料對刺參24 h水質指標的影響

2.1.1 pH值變化（見圖1）

由圖1可知，六個實驗組在飼料投喂的24 h內變化趨勢大致相同。剛投喂飼料時各組pH 值在7.65～7.74 之間。在3 h 之后除了污泥組（pH 值7.76）增長較慢外，其他各組升高幅度較明顯，在7.91～7.93 之間。在隨后的15 h 內各組呈升高趨勢但是漲幅并不明顯，pH 值在7.78～7.93 之間。在最后的3 h 各組pH值均有下降，至24 h各組pH值在7.74～7.85之間。

圖1 不同飼料組24 h pH值變化

2.1.2 溶解氧變化（見圖2）

圖2 不同飼料組24 h溶解氧變化

由圖2 可知，飼料在投喂初始各組溶解氧含量在8.71～9.26 mg/l 之間，在前12 h 內各組溶解氧含量基本保持一致在8.71～9.52 mg/l之間浮動。在以后12 h內污泥組溶解氧含量開始下降，至21 h時污泥組下降至最低點，達到7.84 mg/l，從圖2 可知溶解氧含量比其他組都低。其余各組溶解氧含量變化比較平穩，在8.72～9.94 mg/l之間浮動。

2.1.3 亞硝酸鹽濃度變化（見圖3）

圖3 不同飼料組24 h亞硝酸鹽濃度變化

由圖3可知，各組亞硝酸鹽濃度在投喂初始含量基本一致，在0.008 5～0.011 9 mg/l 之間。在投喂6 h時各組均降至最低點，在0.007 4～0.007 6 mg/l 之間。此后各組亞硝酸鹽濃度開始增高并且上升幅度較大。在投喂飼料24 h 時各組亞硝酸鹽濃度上升至最高點，在0.016～0.019 mg/l 之間。在亞硝酸鹽濃度上升過程中污泥組的值比其他各組都高。

2.1.4 氨氮濃度變化（見圖4）

圖4 不同飼料組24 h氨氮濃度變化

由圖4可知，除40%和5%活性污泥組外，各組氨氮值在投喂初濃度最低，并且差異不大，各組濃度值在0.208～0.223 mg/l 之間，在隨后的24 h 內各組氨氮含量總體呈升高趨勢。24 h各組氨氮值達到最高點，其中污泥組氨氮值最高（0.467 mg/l），40%活性污泥組氨氮值最低（0.404 mg/l）。從圖4 可以看出污泥組在24 h內氨氮含量比其它組都高，在前6 h表現不明顯，但在隨后的18 h內表現較為明顯。

2.1.5 磷酸鹽濃度變化（見圖5）

圖5 不同飼料組24 h磷酸鹽濃度變化

由圖5 可知，各組活性磷酸鹽在投喂初含量較低，在0.042 mg/l（對照組）與0.067 mg/l（50%活性污泥組）之間。以后各組磷酸鹽含量均呈上升趨勢。其中污泥組在第6 h上升至最高點（0.097 mg/l），隨后含量在0.092（12 h）～0.093 mg/l（24 h）之間，變化較為平穩。其余各組含量均比污泥組低，其中對照組在24 h時含量最低。

2.1.6 化學耗氧量變化（見圖6）

圖6 不同飼料組24 h化學耗氧量變化

由圖6 可知，各組化學耗氧量初始值在3.36～3.60 mg/l之間，在24 h內各組變化不明顯。污泥組在6 h 后含量達到最高點（3.86 mg/l），此后含量略有下降，在3.71～3.76 mg/l 之間浮動。其余各組含量均小于污泥組。對照組含量在24 h 內較低，除了在18 h（3.46 mg/l）高于50%活性污泥組（3.35 mg/l）外，其余時間均低于其他實驗組。

2.2 各組刺參對飼料的消化率（見表2）

由表2可知，在60 d四個周期中各組刺參對飼料的消化率總體呈上升趨勢；其中對照組刺參飼料消化率和對飼料粗蛋白質消化率最高，其次為20%活性污泥組，與其它組均差異顯著（P＜0.05）。而污泥組刺參對飼料及粗蛋白質消化率最低。在投喂15 d后，各組刺參隨著投喂活性污泥的比例增加，刺參對飼料總消化率及粗蛋白質消化率總體呈現遞減趨勢；從四個周期（60 d）各組刺參對飼料脂肪消化率來看，20%活性污泥組刺參對粗脂肪消化率最高，污泥組刺參對粗脂肪消化率最低，與其它各組差異顯著（P＜0.05）。在實驗前30 d，投喂活性污泥刺參粗脂肪消化率高于對照組。在實驗后30 d，50%活性污泥組粗脂肪消化率與對照組差異不顯著（P＞0.05）；前30 d對照組刺參糖消化率最高，與其他各組差異顯著（P＜0.05）。后30 d 20%活性污泥組刺參糖消化率最高，與對照組差異性顯著（P＜0.05）。污泥組刺參對糖消化率最低，與其他各組均差異顯著（P＜0.05）。

2.3 飼料對刺參營養組分的影響（見表3）

分別在實驗的第30 d和第60 d對各組刺參隨機取樣，測定刺參體壁的粗蛋白質、粗脂肪、總糖、灰分和水分。第30 d時，30%活性污泥組刺參粗蛋白質含量最高，與其他五組差異顯著（P＜0.05），污泥組刺參粗蛋白質含量最低，其中C、D、F組刺參粗蛋白質含量差異不顯著（P＞0.05）；對照組和30%活性污泥組刺參粗脂肪含量最高，兩組之間差異不顯著（P＞0.05）。對照組刺參粗脂肪含量最高，與20%和30%活性污泥組差異不顯著（P＞0.05），但與污泥組、40%和50%活性污泥組差異顯著（P＜0.05）。對照組總糖含量最高，20%活性污泥組次之，兩組之間差異不顯著（P＞0.05），污泥組總糖含量最低，與各組差異顯著（P＜0.05）；污泥組灰分含量最高，與其他五組差異顯著（P＜0.05），30%活性污泥組含量最低，與其它組差異顯著（P＜0.05）。

表2 四個周期（60 d）不同飼料組刺參對飼料的消化率(%)

表3 不同飼料組刺參基本營養成分（干重%）

第60 d時，30%活性污泥組刺參粗蛋白質含量最高，與其它組差異顯著（P＜0.05）。污泥組含量最低并與其它組差異顯著（P＜0.05）；A、D、E、F組刺參粗脂肪含量最高，四個組之間差異不顯著（P＞0.05）。污泥組和50%活性污泥組粗脂肪含量最低，兩組差異不顯著（P＞0.05）；A、E組和F組刺參總糖含量最高，三組間差異不顯著（P＞0.05）；污泥組灰分含量最高，20%活性污泥組最低，除了C組和D組差異不顯著外（P＞0.05），其余各組之間差異顯著（P＜0.05）。

2.4 不同投喂組刺參腸道蛋白酶比活力（見圖7）

第30 d 對照組刺參腸道蛋白酶比活力最高（0.560 U/mg），污泥組腸道蛋白酶比活力最低（0.142 U/mg.），6 組刺參腸道蛋白酶比活力均差異性顯著；第60 d 對照組的刺參腸道蛋白酶比活力（0.650 U/mg）和20%活性污泥組（0.516 U/mg）較高，兩組之間差異顯著（P＜0.05）。污泥組腸道蛋白酶比活力最低（0.182 U/mg），與其他五組差異均顯著（P＜0.05）。D、E兩組腸道蛋白酶比活力差異不顯著（P＞0.05）。

圖7 不同飼料組刺參腸道蛋白酶比活力

2.5 不同投喂組刺參腸道淀粉酶比活力（見圖8）

圖8 不同飼料組刺參腸道淀粉酶比活力

第30 d 對照組刺參腸道淀粉酶比活力最高（3.32 U/mg），污泥組淀粉酶比活力最低（1.31 U/mg），六組之間E 組與C、E 組與F 組差異不顯著（P＜0.05）；第60 d 20%活性污泥組刺參淀粉酶比活力最高（4.49 U/mg），與其它五組差異顯著（P＜0.05）。污泥組和50%活性污泥組淀粉酶比活力最低，兩組之間差異不顯著。

2.6 不同投喂組刺參腸道纖維素酶比活力（見圖9）

第30 d 對照組刺參腸道纖維素酶比活力（0.046 U/mg）和20%活性污泥組刺參腸道纖維素酶比活力（0.045 U/mg）最高，兩組之間差異不顯著（P＞0.05）。污泥組最低（0.017 U/mg），與其它五組差異顯著（P＜0.05）；第60 d 20%活性污泥組（0.063 U/mg）和對照組（0.056 U/mg）最高，兩組之間差異不顯著（P＞0.05）。污泥組腸道纖維素酶比活力最低（0.032 U/mg），并且與其它五組差異顯著。

圖9 不同飼料組刺參腸纖維素酶比活力

3 討論

3.1 飼料對刺參養殖水質的影響

實驗組飼料是添加大菱鲆代謝廢物（污泥）和經過流化床曝氣處理的代謝廢物（活性污泥）。這些代謝廢物主要成分是碳水化合物、脂肪、蛋白質、磷等有機質，另外還包括工廠化養殖中未被大菱鲆攝食的殘餌等。將它們作為飼料投入水中，可能會對刺參養殖水體產生一定的負面影響。苗淑彥等[8]認為水產動物代謝廢物能夠消耗水中溶氧，使水中H2S 含量增加，影響正常的消化作用，對養殖動物具有毒害影響。付成東等[9]研究顯示養殖殘餌和糞便會加速厭氧細菌繁殖，促進有機質轉化成氨氮和硫化氫，導致養殖水體富營養化。通過本實驗數據我們看到各組水質晝夜pH值變化不大，在7.65～7.93之間；實驗中不間斷充氧所以各組之間溶氧含量差異不大，晝夜幅度在7.85～9.94 mg/l之間，基本能夠滿足刺參對水質溶解氧的要求。在氨氮、亞硝酸鹽、活性磷酸鹽、化學耗氧量等指標，污泥組的濃度比對照組和活性污泥組都高，而對照組和活性污泥實驗組間差異不大。Seymour等[10]研究顯示在魚類養殖中1噸魚的排泄物會產生9 kg磷、52 kg氮和500 kg生物耗氧量。Gowen等[11]認為，養殖50噸魚1年會產生19.4噸有機碳、2.2噸有機氮和4噸可溶性含氮化合物。因此把魚類代謝廢物作為刺參飼料添加劑，在平時養殖管理中要及時檢測水質，嚴格控制水中有害成分的含量。本實驗中的活性污泥通過流化床上附著在生物膜上的硝化細菌等有益菌可以有效去除氮、硫污染物[12-13]，對養殖水質的影響較小。另外在養殖實驗過程中每天全量換水，因此養殖水質的各項指標基本符合刺參正常生長要求。

3.2 刺參對飼料營養成分消化的影響

消化率是影響水產動物生長的重要指標，有研究表明影響水產動物消化率的因素有餌料營養成分、環境水溫、飼料形狀大小和動物生理狀況等[14-15]。本實驗前期刺參對活性污泥的吸收率低于刺參商品飼料，但實驗后期刺參對活性污泥的吸收率均有不同程度的提高，說明刺參對活性污泥飼料具有一定的適應性。在活性污泥飼料中刺參對20%添加量的飼料吸收率較好，尤其在實驗后期添加20%的活性污泥刺參對糖和粗脂肪的消化率最高。脂類是重要的能源物質，水產動物對脂類的吸收可以促進生長，降低對飼料粗蛋白質的需求。有研究表明對蝦飼料脂肪最適量為6%～10%之間[16]，海水魚類飼料脂肪含量最適量為10%～13%[17]。刺參屬于低營養級的沉食性生物，消化器官較簡單，自身對營養物質的消化率較低，有研究顯示刺參較魚類和對蝦對脂肪需求量較低，飼料最適含量為5%[4]。本實驗活性污泥飼料的脂肪含量較商品飼料高，適量地增加脂肪含量可以促進刺參的生長，與王吉橋等[18]研究結果一致。在水產飼料原料中糖類是較為經濟的能源物質，可以直接為動物提供能量來源[19]。本實驗刺參對污泥和活性污泥的糖類消化率較低，可能與飼料中糖類原料的成分有關，有待進一步的研究。

3.3 飼料對刺參體壁營養組成和腸道消化酶比活力的影響

刺參體壁為主要食用部位，是衡量刺參營養品質的重要部位。干品刺參蛋白質含量為34%～60%，總脂含量為3.5%，糖類含量在2.1%～3.8%，灰分含量可達28%～37%[20-22]。本實驗各組刺參經過60 d 養殖體壁的營養成分均有增加，其中投喂30%活性污泥的刺參體壁蛋白質含量較高，說明活性污泥可以作為餌料有效增加刺參的營養成分。投喂污泥的刺參體壁各項營養成分都較低，與刺參對污泥營養成分的吸收率低有一定關系。刺參消化酶大部分集中在消化道的前腸和中腸，消化酶的活力能夠體現刺參對餌料消化吸收的能力[23]。刺參消化酶活性受水溫、鹽度、餌料成分、水質環境等因素影響[24-25]。實驗中各組刺參消化酶比活力均有提高，其中投喂商品飼料的刺參蛋白酶比活力較高，投喂20%活性污泥的刺參淀粉酶和纖維素酶比活力較高，大體與各組刺參對飼料粗蛋白質和糖類營養成分的吸收率有一定關系。投喂污泥的刺參消化酶比活力最低，可能與污泥對養殖水質的影響有關。污泥投入水中后氨氮和亞硝酸鹽含量較其它各組高，會影響刺參的攝食行為。胡煒等[26]研究表明氨氮脅迫對刺參生長和消化酶活性具有明顯的影響作用。如何充分利用污泥替代蛋白質飼料原料，不僅要考慮營養組分的搭配比例，還要考慮飼料對養殖環境因子的影響。

4 結論

飼料中添加適量活性污泥不會對養殖刺參水質造成危害影響，同時活性污泥作為一種粗蛋白質飼料來源，易于被刺參消化吸收，能夠改善刺參營養成分和消化酶比活力。