拷貝數變異致高IgM綜合征1例并文獻復習

朱曉娜 夏 宇 楊 軍

1 病例資料

男，14月齡，因“反復感染1年余，腹脹伴間斷發熱3個月”于2018年2月就診于深圳市兒童醫院(我院)風濕免疫科。

患兒生后2 d出現呼吸道感染，4月齡腋窩膿腫，5月齡重癥肺炎伴巨細胞病毒(CMV)感染，間斷給予IVIG治療，仍出現多次下呼吸道感染，12月齡馬爾尼菲青霉菌敗血癥，13月齡反復腹脹、輪狀病毒腹瀉，伴生長發育遲緩及肝脾腫大。曾予呼吸機輔助呼吸，利奈唑胺、萬古霉素、美羅培南、頭孢哌酮舒巴坦、更昔洛韋、伊曲康唑和伏立康唑等抗感染。

既往史：無乙肝、結核等傳染病史及接觸史，“青霉素”過敏史，無食物過敏史，既往曾行膿腫切開引流術，無外傷史，無異物吸入史。

個人史：患兒系G3P2，足月順產，出生體重3 350 g，生后母乳喂養至12月齡，6月齡添加輔食，現普食。2月齡會抬頭，4月齡會坐，11月齡會站，13月齡尚不能獨走、精細抓物和叫爸爸媽媽。未按時預防接種。

家族史：父母體健，否認家族遺傳病史，父母非近親婚配。

體格檢查：T 37℃，HR 115·min-1，R 24·min-1，體重9.5 kg(P3～P10)，身高73 cm(

圖1 患兒皮膚黃染及腹壁靜脈曲張

輔助檢查：血常規WBC (9.30～13.16)×109·L-1，N (1.29～5.34)×109·L-1，L (3.62～4.24)×109·L-1，PLT (115～188)×109·L-1，Hb 95～100 g·L-1，ESR 57 mm·h-1，PCT 0.2～27.4 ng·mL-1。體液免疫指標IgG 0.37 g·L-1，IgA 0.04 g·L-1，IgM 1.21 g·L-1，IgE 0.1 IU·mL-1。淋巴細胞免疫分析CD3+80.9%，CD4+54.9%，CD8+23.2%，CD19+15.4%，CD16+CD56+1.96%，總T淋巴細胞計數2 440·μL-1，CD4+T淋巴細胞計數1 751·μL-1，CD8+T淋巴細胞計數740·μL-1，B淋巴細胞計數438·μL-1，NK細胞計數56·μL-1。肝功能AST 98～209 IU·L-1，ALT 138～414 IU·L-1，TBIL 29.6～92.1 μmol·L-1，DBIL 21.0～69.1 μmol·L-1。甲狀腺功能FT33.3 pmol·L-1，T30.8 nmol·L-1，FT47.3 pmol·L-1，T499.9 nmol·L-1，甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)49.8 U·mL-1，甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)81.1 IU·mL-1。直接Coombs試驗可疑，間接Coombs試驗陰性。血培養(馬爾尼菲青霉菌+)；真菌D-葡聚糖420.4 pg·mL-1；血CMV DNA 5.1×102拷貝·mL-1；糞便沙門氏菌核酸檢測陽性。骨髓細胞學檢測示，骨髓增生明顯活躍，成熟階段中性粒系比例減低，嗜酸性粒細胞增多癥(中度)。胸部CT示，兩肺散在多發間質性病變，兩側少量胸腔積液(圖2A)。上消化道超聲：食管下段及胃底靜脈迂曲、擴張。上消化道CT平掃+增強+三維重建：肝臟增大，格林生系統增寬，門靜脈較細小，第一肝門區分支增多、迂曲，考慮肝門靜脈海綿樣變性，脾臟體積增大，肝門區及腹膜后軟組織樣密度影(圖2B)。

圖2 患兒胸部、腹部CT

免疫分型：表2顯示，根據文獻報道[1]的方法進行淋巴細胞精細分型(BD公司，美國)。流式細胞儀檢測淋巴細胞亞群，結果顯示，T、B淋巴細胞數量正常，記憶B細胞及漿細胞明顯減少(均為0)。

經患兒監護人知情同意，對患兒及其父母進行應用免疫整體捕獲方案(邁基諾，北京)進行全外顯子測序，依據1000 Genomes Project，Exome Variant Server(EVS)及Exome Aggregation Consortium(ExAc)數據庫，濾除人群中突變頻率>1%的變異，去除每個外顯子及上下游各50 bp內含子變異、同義變異(除外位于剪切位點的變異)等，同時使用SIFT、PolyPhen等軟件對篩選出的突變對蛋白功能的影響進行預測。根據美國遺傳學與基因組學學會(ACMG)制定的指南篩選出可能致病的突變[3]。結果顯示，全外顯子測序點突變分析未見可疑致病突變位點。

拷貝數變異分析：采用cnvkit軟件，利用同一pool捕獲的樣本作對照進行分析。統計target區域和非target區域的reads深度，然后在樣本內對深度進行均一化和矯正，和對照集進行比較計算，得到拷貝數的信息，用循環二元分割算法(CBS)對區域進行分割。通過Reads數分析發現患兒CD40LG片段疑似缺失(圖3)。

CD40LG基因外顯子熒光定量PCR：提取患兒及其父母基因組DNA，根據CD40LG基因的不同外顯子設計引物(表2)，應用ROCHE480PCR儀，20 μL體系擴增，記錄Ct值，采用文獻[4]報道的方法進行數據分析。患兒平均Ct值為35，CD40LG基因1～5號外顯子大片段缺失。其父親和母親平均Ct值分別為26.1和25.8，差異無統計學意義(P>0.05)(圖4)。

圖3 患者X染色體(Xq25-28)二代測序reads分析結果

圖4 患者家系CD40LG基因各外顯子qPCR擴增結果

注 P：患兒；PF：患兒父親；PM：患兒母親；E1-E5：CD40LG基因DNA1至5號外顯子

CD40LG基因cDNA凝膠電泳：使用RNAiso Blood試劑盒(Takara公司，日本)提取RNA，應用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara公司，日本)完成患兒及其父母和正常對照的RNA的反轉錄。根據CDS序列設計上下游引物(表2)，反應體系為25 μL，退火溫度為60℃。擴增完成后，對產物進行凝膠電泳。患兒CD40LG基因CDS序列cDNA擴增無產物，其父母cDNA擴增有產物(圖5)。

流式細胞術檢測淋巴細胞CD40L的表達情況：采集患兒、患兒母親和健康對照者靜脈血0.2 mL，與RPMI-1640(Thermo Fisher公司，美國)培養基混勻，標記為未刺激管；另取抗凝血0.2 mL，與RPMI-1640培養基、PMA(Sigma公司，美國，1 ng·μL-1)、離子霉素(Sigma公司，美國，50 ng·μL-1)作刺激劑，充分混勻，標記為刺激管，孵育4 h。將患兒、患兒母親和健康對照者的刺激管和未刺激管各分成4管，分別依次加入如下組合抗體(BD 公司，美國)：CD3-PerCP/IgG1-PE/CD8-APC，CD3-PerCP/CDl54-PE/CD8-APC，CD3-PerCP/IgG1-PE，CD3-PerCP/CD69-PE。以CD3+CD8-T淋巴細胞代表CD4+T淋巴細胞群作為分析對象，測定CD40L在其表面的表達情況。患兒CD3+CD8-T淋巴細胞CD40L比例為1.0%，其母親為16.8%，較正常對照明顯減少(1.0%，16.8%vs64.7%)(圖6)。

圖5 患兒家系淋巴細胞CD40LG基因CDS區cDNA擴增后凝膠電泳圖

注 A：患兒及對照；B：患兒父母凝膠電泳

治療與隨訪：入院后先后予頭孢哌酮舒巴坦、米卡芬凈、更昔洛韋、伊曲康唑靜滴及復方磺胺甲噁唑口服抗感染治療，住院期間予丙種球蛋白支持治療及復方甘草酸苷、熊去氧膽酸護肝利膽治療，加用左甲狀腺素片口服治療，患兒好轉出院，出院后定期返院予IVIG治療，中性粒細胞較前升高(2.8～5.34)×109·L-1，仍間斷反復感染，皮膚黃染等肝功能損害較前好轉(18月齡復查ALT 49 IU·L-1，AST 70 IU·L-1)，生長發育仍受限。

2 文獻復習

檢索PubMed、中國知網、萬方和維普數據庫，檢索時間均從建庫至2019年4月11日。英文檢索關鍵詞“Hyper IgM syndrome”，共檢出3 893篇；中文檢索關鍵詞“高IgM綜合征”，共檢出233篇。HGMD數據庫共收錄HIgM綜合征致病突變295個，CD40LG最多見(234個)。常見致病突變類型為錯義突變、無義突變、缺失突變、剪切位點突變，其中以錯義突變最多見。AICDA、CD40、UNG、IKBKG基因較CD40LG報道相對較少，亦以錯義突變最常見。拷貝數變異導致的HIgM綜合征病例的相關文獻共10篇(n=10)，其中英文8例，中文2例。7例為CD40LG基因拷貝數變異，均表現為大片段缺失，2例為國內報道(不含本文報道，P6和P7)；3例為AICDA基因拷貝數變異，亦為大片段缺失，余致病基因無拷貝數變異(表3)。

表3 CNV所致HIgM綜合征病例匯總

注 IgG、IgA和IgM單位g·L-1；IC：胞內區，TM：胞漿區，EC：跨膜區

3 討論

原發性免疫缺陷病(PID)是單基因突變導致免疫器官、免疫細胞及免疫活性分子發生缺陷，最終導致機體免疫功能異常的一組臨床綜合征。PIDs常缺乏明顯的基因型與表型相關性，同一基因不同突變可導致不同的臨床與免疫表型(RAG1基因不同突變可導致SCID、OMENN綜合征等), 而不同的基因突變又可以導致相似的臨床表型(OMENN綜合征可由RAG1、RAG2、LIG4、ADA等基因突變導致)。近年來每年都有很多新的PID致病基因通過NGS被確認。但即使在二代測序技術的幫助下，最高也僅有30%～40%的PID患者得到基因診斷，在二代測序陰性病例中，拷貝數變異(CNVs)越來越受到關注。

CNV是由基因組重排導致的，一般指的是長度>1 kb的大片段拷貝數增加或減少，主要表現為亞顯微水平的缺失和重復[14]。隨著測序技術的廣泛應用，CNV在PID的作用逐漸受到重視，包含DOCK8、CYBB、BTK等在內的數十種PID相關基因已有CNV的相關報道[15]。目前全世界僅7例CD40LG基因大片段缺失報道，加上本文報道共8例，及3例AICDA基因CNV報道，本文為首次系統整理CNV所致高IgM綜合征(HIgM)。

HIgM為免疫球蛋白類別轉換障礙伴或不伴體細胞高頻突變的一種原發性免疫缺陷病，典型的免疫學表現為血IgG、IgA水平下降或缺乏，血IgM水平正常或升高。臨床主要表現為反復感染，如肺部細菌感染、中耳炎、胃腸道感染等，某些機會致病性感染發生率高，如卡式肺囊蟲、隱孢子蟲、弓形蟲感染等，且易罹患某些自身免疫性疾病及惡性腫瘤。經典的HIgM綜合征分為5類：①CD40L缺陷；②CD40缺陷；③活化誘導的胞苷脫氨酶(AID) 缺陷；④尿嘧啶DNA轉葡糖基酶(UNG)缺陷；⑤其他，僅根據表型難以完全明確致病分子。

CD40L屬腫瘤壞死因子超家族成員，表達于活化的CD4+T細胞表面，CD40屬TNF受體家族成員，持續表達于B細胞及單核巨噬細胞、樹突狀細胞等抗原提呈細胞(APC)[16]。CD40-CD40L共刺激信號促進B細胞活化、類別轉換及體細胞高頻突變，誘導記憶B細胞的形成，從而使B細胞產生的抗體由IgM向IgG、IgA或者IgE轉換并且對T細胞依賴性抗原產生高親和力的抗體[17],同時影響CD4+T細胞和樹突狀細胞及巨噬細胞的相互作用，使細胞免疫受損。因此，CD40L的缺陷將導致導致X連鎖HIGM患者IgG、IgE和IgA水平明顯下降，但IgM水平正常或升高；XHIGM患者存在正常數量的成熟B細胞，但是不能轉換為記憶B細胞，記憶B細胞數量減少。

本文患兒以反復感染起病，病程中出現馬爾尼菲青霉菌、鼠傷寒沙門菌等機會致病菌感染，伴中性粒細胞減低及自身免疫性溶血性貧血、橋本甲狀腺炎等自身免疫疾病，外周血IgM水平正常，IgG、IgE和IgA均降低，逐漸出現肝膽系統病變，記憶B細胞及漿細胞明顯減少，臨床符合HIgM表現，由于缺乏陽性家族史，難以明確致病分子。據HGMG數據庫，目前HIgM綜合征致病突變中，最常見的突變類型是點突變，其中錯義突變最為多見。本文患兒二代測序常規生物信息學分析并未見致病突變位點，但患兒臨床表型典型，流式細胞術檢測患兒CD3+CD8-T淋巴細胞CD40L蛋白亦無表達，遂進一步行CNV分析，發現CD40LG基因大片段缺失，進一步擴增其cDNA無產物，從而明確CD40LG基因CNV所致HIgM綜合征。

目前HIgM的基因型與臨床表型的關系尚不明確，但本文患兒大片段缺失與點突變患者臨床表型無明顯差異。例7除HIgM綜合征常見臨床表現外還存在孤獨癥，因曾有報道提示孤獨癥譜系障礙(ASD)患者[18]中有高頻率新發生的CNV，尤其是缺失型CNV，推測其獨特表型可能與CNV影響除CD40LG以外的其他基因有關。本文患兒母親為雜合CNV攜帶者，其CD40L表達降低，與點突變的攜帶者相比，雖無明顯感染表現，但其CD40L表達水平相對低下，因此母系家族中CD40L表達降低可能是作為大片段缺失變異的高危因素。

致謝：感謝邁基諾有限公司史麗娜老師對此文的幫助與指導。