血清相關(guān)因子聯(lián)合循環(huán)miRNA在胰腺癌早期診斷中的應(yīng)用研究

羅奇智 林麗云 周 莉 許建平 羅文沈 王建蔚 楊聯(lián)君 陳斯亮

1.深圳市龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院，廣東深圳 518112；2.深圳市龍崗區(qū)中心醫(yī)院，廣東深圳 518117

胰腺癌是全球范圍內(nèi)最常見的腫瘤之一，并且在我區(qū)也是癌癥致死原因的一種主要類型[1]。大樣本多中心的研究發(fā)現(xiàn)很多基因參與了胰腺癌發(fā)生，因此，對胰腺癌相關(guān)發(fā)病病因及其聯(lián)系相關(guān)基因分析，詳細(xì)了解有關(guān)胰腺癌分子遺傳學(xué)機(jī)制，為后期臨床醫(yī)學(xué)者對胰腺癌診斷、治療提供理論基礎(chǔ)，成為現(xiàn)階段研究熱點問題[2]。通過特異基因?qū)W標(biāo)記和相關(guān)表型改變，上述標(biāo)記作用利于對胰腺癌高危人群識別，使早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)防、治療成為可能[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，通過檢測胰液miRNAs 成分，可作為早期臨床診斷一項指標(biāo)[4]，為探討miRNA-203、CA199、CEA 基因在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用以及作為胰腺癌的早期診斷篩查的分子指標(biāo)的可能性，本研究通過搜集我院胰腺癌患者的病例樣本共計698 例，其中36 例證實為胰腺癌樣本，旨在進(jìn)一步了解其篩查效果。

表1 miRNA-203、CA199、CEA的相對表達(dá)量與臨床病理特征之間的相關(guān)性（±s）

表1 miRNA-203、CA199、CEA的相對表達(dá)量與臨床病理特征之間的相關(guān)性（±s）

臨床病理特征 n miRNA-203達(dá)量 CA199達(dá)量 CEA表達(dá)量 F P性別 女 16 1.59±0.24 1.40±0.25 1.42±0.24 2.940 0.063 男 20 1.65±0.36 1.59±0.15 1.47±0.36 1.790 0.176年齡（歲） ≤60 18 1.49±0.17 1.48±0.36 1.46±0.15 0.070 0.933 ＞60 18 1.46±0.15 1.45±0.13 1.43±0.21 0.150 0.060分化程度 低 12 1.20±0.16 1.36±0.19 1.22±0.14 3.370 0.047 中 12 1.64±0.18 1.56±0.17 1.45±0.17 3.630 0.038 高 12 2.01±0.19 1.23±0.18 1.88±0.25 47.990 0.000浸潤深度 T3+T4 18 1.28±0.14 1.51±0.14 1.25±0.36 6.470 0.003 T1+T2 18 1.56±0.13 1.26±0.14 1.47±0.24 7.380 0.002淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有 20 1.21±0.17 1.97±0.15 1.35±0.36 54.230 0.000 無 16 1.99±0.15 1.30±0.36 1.89±0.19 35.460 0.000遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 無 20 1.67±0.18 1.26±0.19 1.48±0.21 22.430 0.000 有 16 1.05±0.15 1.50±0.17 1.44±0.18 34.200 0.000腫瘤大小 ＞5cm 19 1.45±0.19 1.44±0.17 1.48±0.21 0.230 0.798 ≤5cm 17 1.43±0.17 1.42±0.16 1.41±0.18 0.060 0.943

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入我院擬診斷胰腺癌患者的病例樣本共計698 例，其中有36 例證實為胰腺癌樣本（注：部份病例由深圳市龍崗區(qū)中心醫(yī)院提供），本次試驗開展對胰腺癌浸潤程度按照國際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)分類[5]，并采用國際WHO 診斷標(biāo)準(zhǔn)對淋巴分化進(jìn)行診斷[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者經(jīng)過臨床病理診斷確診為胰腺癌患者；（2）納入對象均為初診患者；（3）術(shù)前未實施有關(guān)治療措施；（4）經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）未簽訂知情同意書；（2）一般資料不全者。胰腺癌組中男20 例，女16例，年齡65～88 歲，平均（71.3±1.6）歲。正常對照組中男452 例，女210 例，年齡64～89 歲，平均（72.4±2.5）歲，兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。具有可比性。

1.2 實驗儀器和試劑

1.2.1 儀器 賽默飛HM340 切片機(jī)，徠卡 Excelsior AS 冰凍機(jī)，奧林巴斯BX53 顯微鏡，美國ABI-750 實時熒光PCR 分析儀，雅培I2000 化學(xué)發(fā)光分析儀。

1.2.2 試劑 RNA 提取試劑及TaqMan RNA 檢測試劑由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供，達(dá)安基因，CEA、CA199 檢測的雅培原裝試劑由深圳市安研有限公司提供。

1.3 實驗方法

所有研究對象抽取外周血，使用雅培I2000 化學(xué)發(fā)光分析儀檢測外周血的血清中CEA 及CA199的表達(dá)情況。本次試驗開展納入對象均予以RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA 提取，miRNA-203 的相對表達(dá)量采用TaqMan RNA 試劑盒檢測，將RNU6 作為內(nèi)參并進(jìn)行校正。試驗開展利用熒光實時定量反應(yīng)，嚴(yán)格按照PCR 操作說明書進(jìn)行。當(dāng)檢測結(jié)果中Ct 數(shù)值顯示為20～32 之外時，需采取第二次檢測。計算采取公式為△Ct=CtmiRNA-203、CA199、CEA-CtRNU6，反應(yīng)miRNA-203 的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以（）表示，采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對樣t檢驗，多組間對比選擇F檢驗，將臨床病例因素作為自變量進(jìn)行多元Logistic回歸分析，采用Pearson相關(guān)性分析計算相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 miRNA-203、CA199、CEA相對表達(dá)量的高低與臨床病例因素之間的關(guān)系

2 結(jié)果

2.1 miRNA-203、CA199、CEA的相對表達(dá)量與臨床病理特征之間的相關(guān)性

miRNA-203、CA199、CEA 的相對表達(dá)量分別為1.036，1.532，1.135，95%CI為0.323～0.534，0.369～0.547，0.412～0.632。miRNA-203、CA199、CEA 相對表達(dá)量與患者的年齡、性別、發(fā)病的部位及瘤組織大小并無相關(guān)性（P＞0.05）；而淋巴受累、腫瘤分期、分化程度、腫瘤侵襲深度、是否轉(zhuǎn)移等方面，CA199、CEA、miRNA-203 相對表達(dá)量的上升（P＜0.05），CA199、CEA、miRNA-203 相對表達(dá)量的上升與淋巴受累、腫瘤分期、分化程度、腫瘤侵襲深度、是否轉(zhuǎn)移風(fēng)險有關(guān)，見表1。

2.2 miRNA-203、CA199、CEA相對表達(dá)量的高低與臨床病例因素之間的關(guān)系

采用Logistic回歸分析分析miRNA-203、CA199、CEA 相對表達(dá)量的高低與臨床病例因素之間的相關(guān)性，CA199、CEA、miRNA-203 相對表達(dá)量的上升增加了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，調(diào)整之后風(fēng)險的OR=5.05，95%CI為1.14～23.45，P=0.004，見表2。

2.3 miRNA-203、CA199、CEA mRNA表達(dá)情況比較

胰腺癌組與對照組miRNA-203、CA199、CEAmRNA 表達(dá)情況比較，胰腺癌組CA199 相對表達(dá)量的上升，CEA、miRNA-203 表達(dá)的下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

3 討論

隨著現(xiàn)階段我國診斷技術(shù)不斷先進(jìn)，對胰腺癌患者實施分子生物學(xué)檢查具有一定優(yōu)勢，能應(yīng)用于疾病早期診斷及其篩查，利于后期疾病治療，改善預(yù)后[7]。現(xiàn)階段臨床對疾病診斷實施采用新技術(shù)，具有特異性差、敏感性低缺點，實際應(yīng)用過程中會存在假陽性、假陰性，實際診斷存在一定缺陷。同時，目前實際研究過程中，對分子標(biāo)志物均是有關(guān)腫瘤相關(guān)性，并非特異性[8-9]。此外，對任何一類腫瘤早期診斷、篩查并非完全依靠單向操作方式完成，現(xiàn)階段胰腺癌篩查、早期診斷均是以多項指標(biāo)聯(lián)合檢測以提高早期診斷率。

表3 miRNA-203、CA199、CEA mRNA表達(dá)情況

癌胚抗原（CEA）診斷胰腺癌的特異度非常高，從而保證了其診斷的準(zhǔn)確性，但是靈敏度卻較低，但是CEA 也因其非器官特異性，影響臨床判斷，因此，不能單一的作為胰腺癌的腫瘤標(biāo)志物[10]。研究表明，胰腺癌血清中存在大量的CA199，并且具有極強的特異性87%和靈敏度79%，在胰腺癌早期診斷及預(yù)后方面都有很高的參考價值[11]。但是CA199 也存在于結(jié)腸腫瘤或膽道或急性膽管炎患者血清中，因此，也不能單一作為胰腺癌的早期診斷分子標(biāo)志物[12]。miRNAs 作為一類具有調(diào)控功能非編碼小分子RNA，并廣泛存在于真核生物中，因此，miRNAs 會因腫瘤組織自身所存在特異性、穩(wěn)定性成為一種潛在分子標(biāo)志物[13-14]。有學(xué)者經(jīng)過Meta 分析發(fā)現(xiàn)，miRNAs 診斷胰腺癌的敏感度高達(dá)89%，特異度高達(dá)93%，血清及其組織中存在異常表達(dá)miRNAs，同時并對血清中miRNAs 進(jìn)行驗證，miRNA-203 可以作為胰腺癌潛在的血清分子診斷標(biāo)志物[15]。

本研究通過聯(lián)合檢測miRNA-203、CA199、CEA 表達(dá)程度及其與臨床特點的相關(guān)性，以期了解miRNA-203、CA199、CEA 基因在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用以及作為胰腺癌的早期診斷的分子指標(biāo)的可能性，結(jié)果顯示，CA199、CEA、miRNA-203 相對表達(dá)量的上升，增加了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，組間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上，miRNA-203、CA199、CEA 的聯(lián)合檢測與胰腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有一定的相關(guān)性，有助于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移篩查及預(yù)測。

摘 要

研究類論文應(yīng)寫成冠以“目的（Objective）、方法（Methods)、結(jié)果（Results）和結(jié)論（Conclusion）小標(biāo)題的結(jié)構(gòu)式摘要。

結(jié)構(gòu)式摘要的“目的”應(yīng)注意與題名范圍對應(yīng)，目的與結(jié)論呼應(yīng)；“方法”需交代病例收集來源、時間，分組方法，研究指標(biāo)及方法，統(tǒng)計學(xué)方法；“結(jié)果”需給出主要指標(biāo)的數(shù)據(jù)，給出統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果（統(tǒng)計量和統(tǒng)計值），結(jié)果中的指標(biāo)應(yīng)與方法中提及的對應(yīng)；“結(jié)論”與目的呼應(yīng)，不做不成熟的論斷；慎用“本研究證實”、“本研究發(fā)現(xiàn)”、“本研究表明”、“本研究顯示”的表述，建議使用“本研究提示”。建議前瞻性臨床試驗研究的論著摘要應(yīng)含有CONSORT 列出的基本要素。綜述、述評、個案報道、經(jīng)營管理、政策研究等方面文章的摘要采用敘述式。

摘要的內(nèi)容應(yīng)包括綜述的主要目的、資料來源、綜述時所選擇的研究數(shù)目及這些研究是如何選擇的、提煉數(shù)據(jù)的規(guī)則及這些規(guī)則是如何應(yīng)用的、數(shù)據(jù)綜合的最重要的結(jié)果和結(jié)論。

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