RUNX3基因甲基化在結直腸癌發生中作用及與預后的關系研究

賈光輝 郭 民

內蒙古自治區烏蘭察布市中心醫院普外科，內蒙古烏蘭察布 012000

結直腸癌（CRC）在全世界范圍內均有較高的發病率，位居全省惡性腫瘤第3 位，近些年受多種因素影響我國疾病發病率呈上升趨勢，早期有效篩查、診斷疾病對改善患者預后、提高患者生存率有重要意義[1]。RUNX3 基因是近年新發現的一種抑癌基因，其通過參與TGF-β 信號傳導調控細胞分化、惡變、凋亡等過程[2]。有研究指出RUNX3 基因表達下調與基因啟動子區域甲基化有關，而RUNX3基因表達下降，會導致TGF-β 信號傳導抑制，造成細胞凋亡失控，從而促腫瘤生長、轉移，其可能成為臨床腫瘤預后評估重要指標[3]。本研究通過觀察結直腸癌組織、正常黏膜組織RUNX3 甲基化狀態，分析基因甲基化與疾病預后的關系，旨在為今后疾病早期診斷提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年5月～2013年11月病理確診為原發性CRC 患者59 例為研究對象，所有患者均行根治性切除治療，醫院倫理委員會審核通過，患者病歷資料完整，未合并其他惡性腫瘤，未行放化療，簽署知情同意書。獲取患者癌組織、正常黏膜組織（距腫瘤邊緣10cm 以上），標本取出后即刻液氮冷卻。患者年齡31～69 歲，平均（47.2±5.3）歲，腫瘤直徑3.5～7.8cm，平均（5.0±1.3）cm，位置：直腸35 例、結腸24 例。

表1 不同組織RUNX3蛋白表達、甲基化狀態[n（%）]

1.2 試劑、儀器

試劑、儀器：DAB 顯色試劑盒、鼠抗人RUNX3單克隆抗體（美國Sigma 公司）、免疫組化SP 試劑盒（福州邁新生物技術有限公司）、DNA 提取試劑盒（中山大學達安基因有限公司）、甲基化酶（美國New England Biolabs 公司）、甲基化試劑盒（美國Zymo Research 公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法 在獲取觀察標本組織后固定（10%甲醛溶液），石蠟包埋、切片（厚度5μm），烘片、脫蠟、脫水，加3%過氧化氫，行抗原高壓熱修復，加封閉液（山羊血清）室溫封閉30min，后加一抗孵育1h（放于濕盒內，在37℃環境下），以PBS沖洗（3 次，5min/次），加二抗覆蓋組織后室溫孵育（30min），PBS 沖洗，加DAB 顯色，蘇木精復染、1%鹽酸乙醇分化，脫水、透明、樹膠封片。

1.3.2 MSP 檢測 以DNA 提取試劑盒提取標本組織中DNA，后以甲基化試劑盒對DAN 進行修飾，后構建反應體系（0.5μL cDNA、2.5μL PCR Buffer、1μL 上 下 引 物、2μL dNTP、0.2TapE、16.3μL dd H2O）行定量PCR 擴增，條件：94℃ 5min（預變性）、94℃ 30s（變性）、65.6℃（M 甲基化反應）或61.2℃（U非甲基化反應）30s（退火）、72℃ 55s（延伸）共35個循環。后以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，自動成像儀照相分析。

引物M，上游：5’TTACGAGGGGCGGTGGTACGCGGG3’，下游：5’AAAACGACCGACGCGAACGCCTCC3’，擴增長度220。

引物U，上游：5’TTATGAGGGGTGGTTGTATGTGGG3’，下游：5’AAAACAACCAACACAAACACCTCC3’，擴增長度234。

1.4 觀察指標

觀察不同組織中RUNX3 蛋白表達及甲基化狀態，所有患者隨訪5年，分析基因甲基化與疾病預后的關系。本次甲基化狀態判斷標準[4]：陽性，僅出現甲基化本條帶或同時出現甲基化、非甲基化條帶；陰性，僅出現非甲基化條帶。RUNX3 蛋白表達以陽性細胞數與顯色強度乘積評分進行評估[5]：陽性，乘積評分2 分以上，陰性，兩者乘積1 分以下；顯色強度：無色0 分，淺黃色1 分，棕黃色2 分，棕褐色3 分；陽性細胞數：0 分為陽性細胞率10%以下，11%～29% 計1 分，2 分 為30%～49%，50%以上為3 分。

1.5 統計學分析

本次數據統計學結果采用SPSS19.0 系統進行分析，計量資料以（）表示，采用t檢驗，計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織RUNX3蛋白表達、甲基化狀態

癌組織中RUNX3 蛋白陽性表達為49.15%低于正常組織94.92%，同時RUNX3 甲基化陽性40.68%高于正常組織0，P＜0.05。見表1、圖1。

圖1 RUNX3 蛋白甲基化狀態（Ma 為標記，N 為正常組織，T 為腫瘤）

2.2 RUNX3甲基化狀態與CRC預后關系

患者隨訪5年，其中24 例死亡、34 例存活、1例失訪，中位生存時間51 個月，對影響患者存活的臨床病理因素進行分析，淋巴結轉移、RUNX3 甲基化狀態與患者存活有關，P＜0.05，與年齡、分期、分化程度無關，P＞0.05。見表2、圖2。

3 討論

腫瘤形成是一個復雜過程，涉及基因異常表達、飲食等多方面，臨床認為表觀遺傳學、基因序列改變是造成腫瘤發生、發展的重要原因，其中表觀遺傳學改變多依靠改變基因甲基化狀態來實現。有研究表明人體中抑癌基因的異常甲基化會抑制癌細胞凋亡，起到促腫瘤發生，致惡性表型的作用，因此有學者提出通過檢測腫瘤患者抑癌基因甲基化狀態，從而來判斷癌細胞侵潤程度、患者預后情況[6-7]。

表2 患者存活的臨床病理單因素分析

圖2 CRC 者RUNX3 甲基化、非甲基化生存曲線

RUNX3 是近些年臨床發現的新型基因，位于染色體lp36.1，全長67kb，其中啟動子p2 可控制基因轉錄，有研究表明RUNX3 蛋白可通過指導TGF-β信號傳導，激活Smad 蛋白復合物，使復合物轉入特定核內靶點位，從而激活相關靶基因，參與細胞周期調控、惡性轉變、分化等過程[8-9]。以往已有學者研究發現RUNX3 基因甲基化與胃癌發生、發展及患者預后相關，此基因甲基化除了在胃癌前病變、早期腺癌形成中發揮重要作用，同時在肺癌、膀胱癌發病中起重要作用[10-11]。但目前有關RUNX3 基因甲基與結直腸癌發生、預后關系的研究較少，故本文對此進行探究分析。本次對CRC 者癌組織、正常組織中RUNX3 蛋白表達及基因甲基化狀態進行比較，發現癌組織中RUNX3 蛋白陽性表達為49.15%低于正常組織94.92%，同時RUNX3 基因甲基化陽性40.68%高于正常組織0，P＜0.05，提示CRC 發生可能與RUNX3 異常表達有關，RUNX3 基因甲基化有腫瘤特異性，基因高甲基化可能與CRC發生、發展有關。本次研究中RUNX3 蛋白表達呈下降趨勢，而基因甲基化狀態表現為升高，提示基因甲基化可能通過阻礙轉錄因子、DNA 之間相互作用，抑制轉錄降低RUNX3 蛋白表達，致Smad蛋白功能受限，從而使細胞對正常分化過程的調節失控，癌細胞擺脫TGF-β 作用，進而促癌發生、發展[12-13]。

有學者發現術前血清CRC 甲基化者復發率高于CRC 非甲基化者，RUNX3 甲基化與CRC 腫瘤分期、淋巴結侵潤有關，其認為血清RUNX3 基因甲基化可能成為疾病早期診斷、治療預后判斷的重要指標[14]。本研究觀察RUNX3 甲基化狀態與CRC預后關系，對患者隨訪5年，5年存活率為57.62%（34/59），繪制CRC 者RUNX3 甲基化、非甲基化生存曲線，發現非甲基化患者累積存活率高于甲基化患者。同時通過對影響患者存活的臨床病理因素進行分析，發現淋巴結轉移、RUNX3 甲基化狀態與患者存活有關，P＜0.05，與年齡、分期、分化程度無關，P＞0.05。結果提示RUNX3 甲基化狀態可作為臨床判斷CRC 患者預后的生物指標，但由于本次研究樣本量較小，且正常黏膜組織取自CRC 患者，無法排出正常人的黏膜組織中RUNX3 表達情況，所得結論存在誤差，仍有待進一步擴大樣本量研究、證實結論[15]。

綜上所述，RUNX3 蛋白表達、基因甲基化狀態在CRC 癌組織、正常組織中存在差異，RUNX3 基因甲基化狀態可能為疾病發生、預后判斷提供依據。