北方地區黑木耳部分主栽品種與野生菌株遺傳多樣性SSR分析*

張躍新，胡 偉，郝藝銘，閆寶松，馬 鳳，么宏偉**

（1.黑龍江省林副特產研究所，黑龍江省非木林產品研發重點實驗室，黑龍江 牡丹江 157011；2.黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036）

黑木耳［Auricularia auricula-judae（Bull.）Quel.］，又稱木耳、黑菜，隸屬真菌門（Eumycota）擔子菌亞門 （Basidiomycotina） 層菌綱 （Hymenomycetes） 木耳目 （Auriculariales） 木耳科 （Auriculariaceae） 木耳屬（Auricularia），是中國傳統的主要食用菌品種［1］。近年來我國應用SSR分子標記技術鑒定黑木耳種質資源取得了較大進展。周雁等［2］對黑木耳和毛木耳轉錄序列進行了微衛星序列分布特征的研究，結果表明三堿基和六堿基重復的微衛星出現最多；馬銀鵬等［3］應用微衛星標記對黑龍江省黑木耳主栽品種進行了遺傳多樣性分析，將黑龍江黑木耳主栽品種分為3大類；徐安然等［4］構建了黑木耳SSR分子身份證。

近年來筆者深入大小興安嶺、長白山、東寧、綏陽、林口、亞布力等地，收集并采集黑木耳野生菌株與主栽品種共23份，應用SSR分子標記技術對黑龍江省區域的部分黑木耳主栽品種及野生菌株進行了遺傳多樣性分析，為黑木耳品種資源鑒定提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

在大小興安嶺、長白山、東寧、綏陽、林口、亞布力等黑木耳主要自然生長地，野外采集的黑木耳菌株8個；收集主要栽培菌株11個，收集地重點選擇黑木耳主要栽培地區；與其他科研院所交換引進的黑木耳登記品種4個。經分離、純化與擴繁培養，獲得純菌株23個，序號分別為菌株1～菌株23。各株菌來源和子實體形態見表1。

1.2 黑木耳DNA提取

從保存的菌株斜面上挑取菌絲塊接種到PDA平板上，于25℃恒溫培養。7 d后用5 mm打孔器切取菌塊接種到液體培養基中，25℃、150 r·min-1恒溫振蕩培養10 d后，將培養液中的菌絲體用無菌紗布過濾，無菌水洗滌多次后，用濾紙吸干水分，液氮速凍后-70℃保存。取50 mg的菌絲體，加液氮研磨成粉末狀，采用基因組DNA提取試劑盒（北京天根） 提取DNA，將提取的DNA溶解于TE緩沖液中，65℃水浴40 min，以充分溶解DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品DNA質量，使用前每個樣品稀釋至濃度為 50 ng·μL-1。

1.3 黑木耳SSR引物設計

在 NCBI網站上 （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）［5］搜索已經發表的黑木耳基因組核酸序列，利用軟件SSRHunter 1.3搜索微衛星位點，在微衛星位點側翼序列上下游各150 bp左右位置，利用軟件Primer Premier 6.0設計黑木耳SSR引物10對，見表2。

表2 黑木耳10對SSR引物Tab.2 Ten SSR primers of Auricularia auricula-judae

1.4 黑木耳SSR-PCR擴增反應條件

反應體系：2.5 μL 10 × PCR Buffer，2.5 μL dNTP（2.5 mmol·L-1），0.5 μL DNA聚合酶（5 U·mL-1），1 μL上游引物（10 μmol·L-1），1 μL下游引物（10 μmol·L-1），1 μL模板DNA（50 ng·μL-1），補去離子水至25 μL。

反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min。

1.5 PCR-SSR引物驗證

以林耳1號為DNA模板，設計的10對引物對目的DNA進行SSR-PCR擴增，PCR產物介于100 bp～500 bp所對應的引物作為目標引物。

1.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳

PCR-SSR產物的變性、制備聚丙烯酰胺變性凝膠電泳板、上板、電泳、銀染等試驗步驟參照文獻［6］。

1.7 數據分析

根據銀染檢測結果，把每1對SSR引物檢測出的1個位點，同時將數據以0-1型數據統計記錄，即有帶記為1，無帶記為0。把每1條多態性條帶記為1個等位基因，以POPGEN32分析所得數據及參數。應用DPS 16.05軟件，根據遺傳距離的類平均法（UPGMA）進行聚類分析，獲得樹狀聚類圖。

2 結果與分析

2.1 黑木耳基因組DNA提取結果

黑木耳基因組DNA提取結果見圖1。

圖1 黑木耳DNA電泳圖Fig.1 DNA electrophoresis picture of Auricularia auricula-judae

對提取的黑木耳DNA進行了瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖1結果表明，23個菌株DNA條帶比較清晰，無拖尾、彌散等現象，說明提取的DNA比較純，基本無降解，符合試驗要求，可用于SSR-PCR反應（M為DL20 000 DNA Marker）。

2.2 SSR-PCR引物篩選結果

SSR-PCR引物篩選結果見圖2。

圖2 SSR引物復篩電泳圖Fig.2 Rescreen electrophoresis diagram of SSR primer

由圖2可以看出，10對SSR引物擴增結果表明，擴增產物長度介于100 bp～400 bp，目標條帶清晰，產物長度符合SSR試驗要求（引物號為表2所示引物編號，M為DL20 000 DNA Marker）。

2.3 不同黑木耳SSR引物的擴增結果

不同黑木耳SSR引物的擴增結果見表3、圖3和圖4。

結果表明，同一SSR引物擴增的不同菌株，擴增的條帶個數與片段大小不盡相同（圖3、圖4）。由表3可以看出，利用10對引物對23個菌株進行分析，共擴增出44個條帶，其中多態性條帶42條，多態性為95.5%。單條引物擴增條帶為2條～7條，平均4.4條，擴增長度介于100 bp～1 000 bp，以300 bp～700 bp居多。擴增條帶數最少的引物為MR003、MR008、MR011，擴增的條帶均為2條；擴增條帶數最多的引物為MR005，擴增條帶為7條。

表3 10對SSR分子標記遺傳多樣性分析Tab.3 Analysis on genetic diversity of 10 SSR molecular markers.

圖3 引物MR005擴增條帶Fig.3 Amplification band of primer MR005

圖4 引物MR010擴增條帶Fig.4 Amplification band of primer MR010

表3的單條引物擴增結果表明，等位基因頻率最小值 0.080（MR011），最大值 0.470（MR005），均值0.201；有效等位基因數最小值1.040（MR008），最大值 1.990（MR005），均值 1.460；各標記位點有效等位基因數小于等位基因數，表明黑木耳基因組存在一些高頻的等位基因。所有標記中MR005擴增效果最好，多態性最為豐富。而MR008表現最差。多態性信息含量0.050～0.320，均值為0.216，Shannon信息指數0.100～0.690，均值0.455，表明供試黑木耳菌株具有遺傳多樣性。

2.4 基于SSR分子標記聚類分析

應用DPS 16.05軟件，根據遺傳距離Nei Li（Czekanowski 1913） 法及類平均法 （UPGMA） 進行聚類分析結果見圖5和圖6。

圖5 基于SSR分析的黑木耳23菌株聚類診斷圖Fig.5 23 strains cluster diagnosis of Auricularia auricula-judae based on SSR analysis

根據聚類類別數診斷圖（圖5），在遺傳相似系數為0.45時，可將聚類結果劃分為4類（圖6）。第1類為菌株林2；第2類為特6；第3類為林5、黑29、黑威15等19個菌株；第4類為林1、林3。聚類結果表明，劃分的4個類群中，第1類只有1個菌株林2，采自于長白山汪清縣，與其他菌株遺傳距離最遠；第2類只有1個菌株特6，來自于黑龍江省林副特產研究所，與其它菌株遺傳距離較遠；第3類包含19個菌株，19個菌株由于地理來源廣泛，且菌株數量較多，是北方地區的主栽類群，該類群在相似系數為0.25時又可將第3類分為3組：第 1組為林 5，第2組為黑29、黑威 15、Au-5、Au-卷邊、Au-Y、Au-碗耳、特2、興安1號、興安2號、林4、林7、林8、林9，第3組為Au特黑、林6、黑山、新代5、林10；第4類只有2個菌株林1、林3，分別來自牡丹江地區的穆棱和林口。

圖6 基于SSR分析的黑木耳23菌株聚類圖Fig.6 Cluster diagram of 23 strains Auricularia auricula-judae based on SSR analysis

3 討論

本研究中供試菌株多數來源于北方地區黑木耳栽培品種及林區采集的野生菌株，其中Au-碗兒引自浙江地區，Au-卷邊引自湖北地區，這兩個品種在北方地區也經過大面積多年栽培，已成為北方地區黑木耳主栽品種。本研究應用SSR法對北方地區黑木耳主栽品種和野生菌株進行了遺傳多樣性分析。研究表明，SSR序列廣泛分布于真核生物基因組中［7-9］。由于SSR標記具有共顯性遺傳、多態性高及在基因組中分布廣泛的特點，廣泛應用于種質資源的鑒定［10-11］、遺傳多樣性的研究［12-13］、遺傳圖譜的構建［14］和基因定位［15-16］等眾多方面。

本研究結果表明，北方地區大部分主栽品種和野生菌株聚到了第3類群-主栽類群，說明該地區黑木耳栽培品種之間及栽培種與野生菌株間遺傳背景差異不大。原因可能有3種：一是設計的引物較少，其擴增的位點未能體現出木耳的遺傳差異性；二是北方地區是我國黑木耳主產區，栽培規模較大，可能發生分生孢子漂移現象，導致野生種與栽培種遺傳距離較近；三是栽培品種間可能出現了相互雜交現象，導致各品種間遺傳距離較近。