降解玉米秸稈的毛頭鬼傘菌株的初步篩選*

楊文琪，黃 亮，孫 寧，王 玉，班立桐，楊紅澎

（天津農學院農學與資源環境學院，天津 300384）

中國的秸稈資源十分豐富，約占農作物生物學產量的60%，其中稻秸稈產量最大，約占總秸稈產量的29.93%；其次是玉米秸稈，約占總秸稈產量的27.39%［1］。秸稈作為天然木質纖維素，約由35%纖維素、15%半纖維素、15%木質素3部分組成。其中木質素呈網狀結構，形成支撐纖維素和半纖維素的骨架，以共價鍵的形式緊密的連接在一起［2］。研究發現，玉米秸稈的木質纖維素極難被分解。這是由于玉米秸稈韌皮部的木質素含量很高，木質素化學結構穩定，導致一般微生物很難降解木質素并分解內部的纖維素［3］。因此，在對玉米秸稈木質纖維素的生物降解過程中，降解木質素是關鍵。

毛頭鬼傘（Coprinus comatus） 屬于傘菌目（A-garicales） 鬼傘科 （Psathyrellaceae） 鬼傘屬 （Coprinus），因其子實體未開傘、形似火雞腿，故又稱為雞腿菇，是一種白腐類蕈菌［4］。Ward G.等［5］的研究表明，白腐類蕈菌對木質素利用沒有選擇性，能夠同時降解木質素、纖維素、半纖維素，可充分利用秸稈中木質纖維素并且釋放大量代謝能量。劉朝貴等［6］用稻草為主要培養基原料，栽培毛頭鬼傘，研究稻草對毛頭鬼傘胞外酶活性的影響。結果表明，毛頭鬼傘在菌絲體生長時期主要利用漆酶，子實體生長時期主要利用纖維素酶。

秸稈木質素的生物降解主要以漆酶為木質素降解酶［7］，纖維素的降解主要依靠羧甲基纖維素酶，半纖維素的降解主要依靠木聚糖酶［8］。研究發現，在PDA培養基中加入芳香類化合物染料，其能與酶類發生顯色或褪色現象，可判斷食用菌能否產生木質素降解酶及產酶能力的強弱［9］。本試驗選取5株不同來源的毛頭鬼傘菌株，通過平板篩選和酶活性檢測等方法，比較其分解玉米秸稈木質纖維素的能力，旨在篩選降解玉米秸稈能力較強的菌株。可為生物降解、循環利用農業廢棄物玉米秸稈資源提供較好的依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株具體情況見表1。

表1 試驗菌株Tab.1 Test strain

1.1.2 供試玉米秸稈

玉米秸稈原料采自天津農學院靜海良種廠試驗地。在烘箱內105℃下殺青2 h，然后80℃烘干至恒重。自然冷卻后用粉碎機粉碎，過60目篩備用。

1.1.3 培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH自然。

PDA-愈創木酚培養基：在1 000 mL PDA培養基上加入0.4 mL愈創木酚。

無機鹽基礎培養基［10］：KH2PO41.0 g、CaCl20.5 g、 CoCl21.7 mg、 FeSO45 mg、（NH4）2SO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、 MnSO4·7H2O 1.6 mg、ZnCl21.7 mg、瓊脂20 g，超純水1 000 mL。

產纖維降解酶液［11］：KH2PO41.0 g、CaCl20.013 g、K2HPO40.4 g、NH4NO30.5 g、VB10.002 5 g、玉米秸稈粉10 g，超純水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 毛頭鬼傘菌株降解玉米秸稈的初篩

1）毛頭鬼傘菌株降解纖維素平板試驗

將保藏的毛頭鬼傘供試菌株，轉接到PDA培養基平板上活化，長滿后用打孔器在平板上制出菌塊。將微晶纖維素（2.0 g） 加入1 000 mL基礎培養基中，制成以纖維素為唯一碳源的固體培養基平板。將菌塊置于固體培養基的中心，23.5℃下培養，每個菌株做3個重復。從菌絲萌發起，每隔24 h用直尺測量菌落直徑，取平均值。

2）毛頭鬼傘菌株降解木質素平板試驗

本試驗采用愈創木酚顯色法，對5個毛頭鬼傘菌株進行漆酶顯色反應試驗，將制備好的菌塊接種到PDA-愈創木酚培養基平板中心，23.5℃下培養，每個菌株3個重復。從菌絲萌發起，每隔24 h進行觀察，分別測量菌落和變色圈的直徑。

3）毛頭鬼傘菌株降解玉米秸稈平板試驗

將玉米秸稈粉（10 g） 加入1 000 mL基礎培養基中，制成以玉米秸稈為碳源的固體培養基平板。試驗方法同上。

1.2.2 液體培養毛頭鬼傘產纖維降解酶的試驗

1）不同毛頭鬼傘菌株產纖維降解酶培養試驗

將初篩中選出的3個毛頭鬼傘菌株，制備菌塊。接入產纖維降解酶液，于23.5℃、150 r·min-1的搖床中培養，從第4天起每隔2 d取樣檢測其所產漆酶、羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的酶活性，3次重復。

2）漆酶、羧甲基纖維素酶和木聚糖酶酶活力的測定

粗酶液制備：取10 mL種子液于離心管中，4℃下4 000 r·min-1離心20 min，取上清液。

漆酶酶活性測定：向96孔板中加入0.15 mL的50 mmol·L-1的醋酸鈉緩沖液，50 μL稀釋10倍的粗酶液，0.1 mL的1 mmol·L-1ABTS，以蒸餾水作為對照，使用酶標儀測定436 nm處5 min內的光吸收值的變化。

羧甲基纖維素酶測定：將1.5 mL的羧甲基纖維素鈉溶液（用pH 5.0的50 mmol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制）和0.5 mL的粗酶液，加入25 mL刻度試管中，40℃水浴保溫30 min。取出后立即加入3 mL DNS試劑，煮沸10 min后冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25 mL，充分搖勻。用酶標儀測定540 nm處的吸光值，以煮沸滅活30 min的酶液作為對照。

木聚糖酶活性測定：將0.9 mL的櫸木木聚糖溶液（用pH 5.0的50 mmol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制） 和0.1 mL的粗酶液加入25 mL刻度試管中，40℃水浴保溫30 min。取出后立即加入3 mL DNS試劑，煮沸10 min后冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25 mL，充分搖勻。用酶標儀于540 nm處測吸光值，以煮沸滅活30 min的酶液作為對照。

2 結果與分析

2.1 毛頭鬼傘菌株降解玉米秸稈的初篩

2.1.1 毛頭鬼傘菌株降解纖維素能力比較

不同毛頭鬼傘菌株降解纖維素能力比較情況見圖1。

由圖1所示，5個毛頭鬼傘菌株在以微晶纖維素為碳源的平板培養基上均可生長，其中長勢較好的菌株為1號菌株、2號菌株、4號菌株，在培養的第7天，其菌落直徑分別達到6.95 cm、6.73 cm、6.26 cm；5號菌株長勢最差，在第7天菌落直徑為5.74 cm。

圖1 不同毛頭鬼傘菌株以微晶纖維素為碳源的生長情況Fig.1 Growth of different strains of Coprinus comatus using microcrystalline cellulose as carbon source

2.1.2 毛頭鬼傘菌株降解木質素能力比較

毛頭鬼傘菌株主要通過漆酶對木質素進行降解。漆酶可以和愈創木酚反應，具有漆酶活性的菌株菌落周圍會呈陽性反應，形成紅棕色顯色圈，且顯色圈直徑、顏色深淺可以有效反應漆酶活性大?。?］。具體結果見表2。

表2 不同毛頭鬼傘菌株產漆酶能力比較Tab.2 Comparison of the laccase production abilities of different strains of Coprinus comatus

從表2中可以看出，5個毛頭鬼傘菌株在愈創木酚平板上均呈紅棕色，發生顯色反應，表示都具有產生漆酶的能力。PDA-愈創木酚培養基的變色圈和菌落直徑會隨著培養時間不斷增長，變色圈顏色的深淺和菌落直徑的大小均存在差異，其中2號菌株、1號菌株、4號菌株變色圈直徑較大、變色程度較深，菌絲生長較快。5號菌株變色圈最小，菌絲生長速度慢。

2.1.3 毛頭鬼傘菌株降解玉米秸稈能力比較

不同毛頭鬼傘菌株以秸稈為碳源生長的情況見圖2。

圖2 不同毛頭鬼傘菌株以秸稈為碳源的生長情況Fig.2 Growth of the different strains of Coprinus comatus using straw as carbon source

從圖1和圖2可以看出，5個毛頭鬼傘菌株在以秸稈為碳源的平板培養基上的生長狀況比在微晶纖維素平板好，1號菌株、2號菌株、4號菌株在第7天，菌落直徑就達到了7.75 cm、7.31 cm、6.92 cm。這是由于玉米秸稈中的營養成分比微晶纖維素復雜和豐富，除了含纖維素還有其他碳源和營養物質［12］。綜上所述，在培養的第6天，1號菌株、2號菌株、4號菌株在微晶纖維素平板、秸稈平板、PDA-愈創木酚平板上，菌落的生長情況均優于3號菌株和5號菌株。

2.2 液體培養毛頭鬼傘產纖維降解酶能力比較

利用平板試驗中篩選出的3株（1號、2號、4號），具有較強降解木質纖維素能力的毛頭鬼傘菌株，在以玉米秸稈為唯一碳源的液體培養基中培養，通過比較玉米秸稈降解過程中羧甲基纖維素酶、木聚糖酶、漆酶的酶活性，進一步判定毛頭鬼傘菌株對玉米秸稈的降解能力。

2.2.1 毛頭鬼傘菌株產羧甲基纖維素酶酶活性的比較

不同毛頭鬼傘菌株產羧甲基纖維素酶酶活性的比較情況見圖3。

圖3 不同毛頭鬼傘菌株產羧甲基纖維素酶活性的比較Fig.3 Comparison of the activity of carboxymethyl cellulase produced by different strains of Coprinus comatus

羧甲基纖維素酶是降解纖維素的相關酶類，由圖3所示，3個毛頭鬼傘菌株在整個液體培養周期中均具有羧甲基纖維素酶酶活性，且隨著培養時間的延長，羧甲基纖維素酶酶活性不斷變化。在培養初期3個菌株的羧甲基纖維素酶酶活性均較低，隨著培養時間的延長，酶活性逐漸升高，在第10天到達峰值，第12天開始下降。其中2號菌株的羧甲基纖維素酶酶活性最高，達到4.05 U·mL-1，高于其他2個菌株，1號菌株和4號菌株的羧甲基纖維素酶酶活性均在3.30 U·mL-1左右。

2.2.2 毛頭鬼傘菌株產木聚糖酶酶活性的比較

不同毛頭鬼傘菌株產木聚糖酶酶活性的比較情況見圖4。

圖4 不同毛頭鬼傘菌株產木聚糖酶酶活性的比較Fig.4 Comparison of the xylanase activity produced by different strains of Coprinus comatus

木聚糖酶是降解半纖維素的酶類，通過圖4可見，3個毛頭鬼傘菌株的木聚糖酶酶活性趨勢大致相同，在培養6 d內，木聚糖酶酶活性水平一直較低，隨后迅速升高，在培養的第10天達到最大值，在第12天有所下降。培養的第10天，1號菌株酶活性最高達到42.36 U·mL-1，其次是2號菌株，菌株酶活性為40.65 U·mL-1，4號菌株最低，酶活性為38.27 U·mL-1，3個菌株木糖酶酶活性均較高。

2.2.3 毛頭鬼傘菌株產漆酶酶活性的比較

漆酶是降解木質素的主要酶類，不同毛頭鬼傘菌株產漆酶酶活性的比較情況見圖5。

圖5 不同毛頭鬼傘菌株產漆酶活性的比較Fig.5 Comparison of the laccase activity of different strains of Coprinus comatus

如圖5所示，3個毛頭鬼傘菌株的酶活表現一致，均呈逐漸上升然后下降的趨勢，在培養的第10天達到最大值，第12天酶活性下降。其中1號菌株漆酶酶活性最高，為10.39 U·mL-1，其次是2號菌株，漆酶酶活性為9.89 U·mL-1，4號菌株最低，漆酶活性為 9.37 U·mL-1。

3 結論

毛頭鬼傘降解玉米秸稈平板試驗中，通過5株毛頭鬼傘菌株在玉米秸稈、微晶纖維素為唯一碳源的平板培養基，以及作為指示劑檢測漆酶含量的PDA-愈創木酚平板培養基上的生長情況，可以初步判定1號菌株、2號菌株、4號菌株具有較強的產木質素、纖維素相關酶類，以及降解木質素和纖維素的能力。

利用平板中篩選出的3個毛頭鬼傘菌株，在以玉米秸稈為唯一碳源的液體培養基進行酶活力測定試驗。結果表明，3個菌株的酶活性變化較一致，培養初期，3個菌株所產酶的酶活性均較低，酶活性從培養的第4天開始逐漸升高，在第10天時酶活性達到峰值，12 d后開始逐漸下降。其中1號菌株的木聚糖酶酶活性最強，在培養的第10天木聚糖酶酶活性達到42.36 U·mL-1，這可能是由于半纖維素成分復雜而誘導產生多種半纖維素酶［13］。并且1號菌株在培養的第8天漆酶活性達到了8.84 U·mL-1，這是因為毛頭鬼傘作為白腐類蕈菌，具有分泌胞外氧化酶降解木質素的能力［14］，所以漆酶在前期增長速度高于其他2種酶，由此可見1號菌株分泌木聚糖酶、漆酶能力均強于其他菌株。通過試驗結果可以看出，毛頭鬼傘菌株能夠產生大量的木質素降解酶，能夠降解秸稈中外層的木質素，促進秸稈內部纖維素和半纖維素的降解，從而充分利用秸稈中的木質纖維素，這與孫江慧的研究結果相一致［15］。綜上所述1號菌株具有降解玉米秸稈的優勢，可為生物降解、循環利用農業廢棄物玉米秸稈資源提供較好的依據。