載脂蛋白C3轉基因小鼠脾臟免疫細胞表型及其活性分析

徐 聰，藺志杰，龔衛娟，賈筱琴，李國利，*

(1．揚州大學醫學院，江蘇 揚州 225009；2．揚州大學護理學院，江蘇 揚州 225009；3．湖北省襄陽市南漳縣中醫院，湖北 襄陽441500)

高甘油三酯血癥與動脈粥樣硬化、肥胖癥、糖尿病、癌癥等多種疾病有關，而且這些疾病的發生往往伴隨著體內免疫功能的紊亂[1]。因此，研究異常代謝環境下，免疫細胞的代謝活性如何被調控繼而影響其生物學功能的發揮，對深度闡明代謝相關性疾病、癌癥等疾病的發病機制具有重要意義。

載脂蛋白C(apolipoprotein C，Apo C)是肝臟中合成的水溶性的低分子質量蛋白質，包括4種亞型：Apo C1/2/3/4。Apo C主要存在于乳糜微粒、極低密度脂蛋白和高密度脂蛋白中，在人體脂質代謝中起重要的作用。載脂蛋白C3基因位于第11號染色體11q23.1-q23.2基因簇內，全長約3.1 kb。Apo C3分子主要在肝臟合成，存在于各種脂蛋白中，小腸亦可合成少量。Apo C3主要抑制脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)活性，并且抑制肝臟攝取富含甘油三酯脂蛋白及其殘粒。體內異常增高的Apo C3可引起高甘油三酯血癥[2]，Gaudet等[3]研究報道阻斷Apo C3基因的表達，可顯著降低甘油三酯的濃度。Apo C3基因多態性被發現與動脈粥樣硬化[3]、冠心病[4]、胰腺炎[5]、非酒精性脂肪肝[6]、痛風[7]和癌癥[8]等多種疾病有關。高甘油三酯血癥引起的動脈粥樣硬化、糖尿病、脂肪肝、胰腺炎、癌癥等疾病往往伴有慢性炎癥，與相關炎癥細胞如巨噬細胞、T細胞和NK細胞的異常浸潤有關[9]。目前已有研究表明，Apo C3參與了多種調節炎癥和免疫細胞分化的功能[10]。Apo C3的靶蛋白脂蛋白脂酶LPL主要表達于血管內皮細胞、脂肪細胞、心臟和骨骼肌等細胞。Apo C3通過抑制TRLs分解及影響HDL代謝，激活血管內皮細胞和單核細胞促進各種炎癥發生。血液中Apo C3濃度亦與胰島素抵抗以及胰島β細胞失活呈正相關。2006年，Hotamisligil[11]在《Nature》雜志上首次提出了“代謝性炎癥(metaflammation)”的說法，使越來越多的人關注到代謝與免疫的相互影響。那么Apo C3對小鼠脾臟免疫細胞頻率及其抗腫瘤生物活性有何影響。圍繞此問題，本課題組引進了Apo C3轉基因小鼠，基于此模型初步探討Apo C3轉基因小鼠的脾臟免疫細胞表型及活性。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

紅細胞裂解液、玻璃毛細管，購于杭州碧云天公司；Percp-cy5.5 anti-mouse CD3抗體、APC antimouse CD19抗體、APC anti-mouse CD4抗體、Percp-cy5.5 anti-mouse CD8抗體、PE anti-mouse NKG2D抗體、APC anti-mouse CD11c抗體、FITC anti-mouse NK1.1抗體、APC anti-mouse F4/80抗體、Percp-cy5.5 anti-mouse Gr-1抗體、Percp-cy5.5 anti-mouse CD107a等，購于美國eBioscience公司；FACS Calibur流式細胞儀，購于美國BD公司；酶標儀，購于Thermo Infinity公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及飼養 SPF級ICR小鼠，購自南京大學模式動物研究所。所有動物的健康狀況均滿足國家規定的實驗動物健康標準。其中，Apo C3轉基因小鼠12只，鼠齡8~10周，雄性；另選鼠齡/性別匹配的野生型ICR雄性小鼠12只，作為對照組。實驗動物飼養于揚州大學醫學院實驗動物中心，飼養條件為SPF級。標準實驗動物飼料喂養，自由飲食飲水。

1.2.2 小鼠血漿甘油三酯(TG)檢測 為了確定血漿甘油三酯水平，將小鼠禁食16 h并從球后靜脈叢取血100 μL。使用甘油三酯測定試劑盒以酶反應顯色比色法檢測，使用酶標儀測定血漿甘油三酯水平，具體步驟按試劑盒說明書操作。

1.2.3 脾臟單細胞懸液的制備 頸椎脫臼法處死小鼠，置于75%酒精中浸泡5 min。在超凈臺內無菌條件下取脾臟放入60 mm培養皿中，其內預先鋪有一張200目的尼龍濾網并加入3 mL無菌PBS緩沖液。磨碎脾臟，經200目尼龍濾網濾過并收集至離心管中，4℃離心，1 500 r/min，5 min，棄去上清。加入2 mL商品化的紅細胞裂解液，吹打均勻后室溫裂解5 min，再加入5 mL無菌PBS緩沖液終止裂解，離心并棄去上清。3 mL無菌PBS緩沖液洗滌細胞一遍后，1 mL無菌PBS緩沖液重懸細胞，用200目的尼龍濾網過濾，即為制備好的脾臟單細胞懸液。

1.2.4 流式細胞術檢測脾臟免疫細胞表型及活性 從脾臟單細胞懸液中取出50 μL，分裝入無菌EP管中，加入FITC anti-mouse CD4抗體、PE anti-mouse CD19抗體、PE anti-mouse CD44抗體、APC antimouse CD8抗體等所有要標記的抗體，4℃孵育30 min。200 μL PBS緩沖液重懸細胞，置于冰上，采用流式細胞儀檢測，操作時盡量采取避光處理。

1.2.5 流式細胞術檢測CD8+T細胞表面CD107a表達 用RPMI-1640完全培養基重懸結腸癌MC38細胞，調整濃度為1×106/mL，脾臟細胞作為靶細胞。將MC38與脾臟單細胞懸液以1∶1、1∶3、3∶1比例混合，置于U型孔，37℃ CO2培養箱孵育2 h，加莫能菌素(monensin，2 μmol/L)繼續孵育 3.5 h 后加 APC anti-mouse CD8抗體、Percp-cy5.5 anti-mouse CD107a避光孵育0.5 h，PBS緩沖液洗滌3次后，采用流式細胞儀檢測。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 6軟件處理所有實驗數據統計圖。應用SPASS 17.0統計分析軟件，采用Dunnettt檢驗分析轉基因(Apo C3)與野生型(WT)小鼠之間的差異，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 Apo C3轉基因小鼠體質量及血漿甘油三酯的變化情況

雄性Apo C3轉基因小鼠和鼠齡/性別匹配的野生型小鼠體質量變化無明顯差異(圖1A)。與野生型小鼠相比，Apo C3轉基因小鼠在斷奶后血漿TG濃度顯著升高(圖 1B)。

圖1 Apo C3轉基因小鼠發生高甘油三酯血癥

2.2 檢測小鼠脾臟免疫細胞頻率及活性

采用流式細胞術對小鼠脾臟免疫細胞進行檢測，結果顯示與野生型小鼠相比，Apo C3轉基因小鼠脾臟CD3+CD8+、CD3+CD8+NKG2D+和 CD3+CD8+CD44+細胞頻率增多(圖 2)，CD8+CD62L-CD44+、CD8+CD44+KLGR1+頻率升高(圖3)，以效應性T細胞為主，且CD8+T細胞分泌IFN-γ水平增強(圖4)；脾臟CD3-NK1.1+、CD3-NK1.1+NKG2D+細胞頻率明顯減少(圖 5)；髓系抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)細胞頻率增加(圖 6)；脾臟 CD3+CD4+NKG2D+、CD3+CD4+IL-17+細胞頻率無明顯變化(圖7)，調節性T細胞、NKT細胞、γδT細胞、B細胞和巨噬細胞頻率亦無明顯變化(圖8~11)。

2.3 Apo C3轉基因小鼠CD8+T細胞活化后CD107a表達水平

流式細胞術分析CD8+T細胞CD107a表達，結果顯示結腸癌細胞MC38與Apo C3轉基因小鼠脾臟單細胞懸液以1∶1、1：3、3∶1的效靶比培養72 h后，在效靶比1∶1時Apo C3轉基因小鼠CD8+T細胞表達CD107a明顯上調(圖12)。

圖3 流式細胞術檢測Apo C3轉基因小鼠脾臟CD8+T細胞的表型

3 討論

高甘油三酯血癥是最常見的脂質紊亂表現。代謝和免疫之間復雜而密切的相互作用可以說是機體穩態調節的核心機制[12]。高甘油三酯血癥及其富含甘油三酯脂蛋白殘余物的代謝后遺癥能致使動脈粥樣硬化，導致冠狀動脈疾病發生的風險和進展增加。高甘油三酯血癥與動脈粥樣硬化、糖尿病、癌癥等多種疾病有關，而且這些疾病的發生往往伴隨著體內免疫功能的紊亂。

圖4 胞內染色法檢測Apo C3轉基因小鼠脾臟CD8+T細胞分泌IFN-

圖5 流式細胞術檢測Apo C3轉基因小鼠脾臟NK細胞頻率

圖6 流式細胞術檢測Apo C3轉基因小鼠脾臟髓系抑制性細胞頻率

圖7 流式細胞術檢測Apo C3轉基因小鼠脾臟CD4+T細胞的頻率及活性

圖8 流式細胞術檢測Apo C3轉基因小鼠脾臟調節性T細胞的頻率

我們運用了Apo C3轉基因小鼠模型進行研究，發現與野生型小鼠對比，體質量變化無明顯區別，且轉基因小鼠表現出更高的血漿甘油三酯水平，血清顏色為乳白色。轉基因小鼠脾臟中CD8+T細胞頻率增加，且活化的CD8+T細胞中CD3+CD8+CD44+，CD3+CD8+NKG2D+細胞的頻率顯著增加。T細胞活化后分化為效應性和記憶性T細胞，因此用效應性T細胞殺傷細胞凝集素樣受體1(KLRG1)[13]來檢測，發現CD8+CD44+CD62L-，CD8+CD44+KLGR1+細胞的頻率均顯著增加，表明活化的CD8+T細胞中主要以效應性T細胞為主。在CD8+T細胞與結腸癌細胞MC38共培養條件下，CD8+T細胞的生物殺傷活性明顯增強，同時，轉基因小鼠脾臟中CD4+T細胞頻率及表型無顯著變化，NK細胞的頻率降低，MDSC細胞的頻率升高。這些結果表明，Apo C3轉基因小鼠在甘油三酯水平顯著升高的條件下脾臟免疫細胞的表型及活性發生明顯變化。對于免疫細胞群而言，淋巴細胞的功能主要受到局部微環境生長因子(如細胞因子IL-2、IL-3、IL-4等)和細胞自身代謝變化的調控[14]。當局部養料或能量供給發生變化(如腫瘤或炎癥微環境)時，對淋巴細胞的功能活性可產生重要影響[15]。在免疫細胞群中，T細胞在免疫應答過程中發揮中樞的作用，可分為CD4+T細胞和CD8+T細胞兩個不同的亞群。Wang等[16]發現CD8+T細胞發揮免疫作用是不依賴CD4+T細胞的，在炎癥感染的后期階段CD8+T細胞激活并產生細胞因子，CD8+T細胞主要通過產生高度表達的穿孔素，對靶細胞發揮細胞毒性作用(CTL)，裂解被感染的巨噬細胞，使其發生凋亡，是炎癥免疫應答的一個關鍵的因素。這解釋了Apo C3轉基因小鼠脾臟T淋巴細胞中，主要是以CD8+T細胞發揮免疫應答作用，而CD4+T細胞的頻率及活性無明顯變化。NKG2D是表達于NK、CD8+T、NKT、γδT以及部分巨噬細胞表面的活化性受體。當NKG2D與其配體MHC I類相關分子(MHC class I chain-related protein，MICA或MICB)結合后，激活NK和CD8+T淋巴細胞，成為機體發揮抗免疫活性的關鍵分子[17-18]。本實驗發現活化的CD8+T細胞頻率增加，我們認為較野生型小鼠而言，Apo C3轉基因小鼠誘發高甘油三酯血癥可能導致機體產生炎癥反應，從而使機體內免疫功能紊亂，免疫細胞頻率及表型發生變化，活化的CD8+T細胞以效應性T細胞發揮主要作用。同時，T淋巴細胞也是介導抗腫瘤免疫應答的重要細胞群，其中Treg、Th17、Th22細胞亞群是能夠促進腫瘤進展的負性免疫調控細胞，我們檢測到CD8+T細胞的CD107也表達升高，說明其抗腫瘤能力明顯提高。而NK細胞可快速分泌多種細胞因子參與免疫應答及調控，研究表明[19]，代謝性炎癥這種微環境可改變NK細胞的表型，脂肪組織能使NK細胞活化并產生大量促炎細胞因子，但本研究中著重檢測轉基因小鼠脾臟組織中的NK細胞頻率，其表現為下調，因此我們猜測在不同組織中，NK細胞的頻率變化不同，脾臟中NK細胞表達變化和脂肪組織中的不同之處及其發生機制將在后續實驗中繼續探討。另外，髓系抑制性細胞(MDSC)是樹突狀細胞(dendritic cell，DC)、巨噬細胞和粒細胞的前體，是一群具有很強免疫抑制功能的異質性細胞，在疾病的進展和轉歸中起重要調節作用[20]。小鼠MDSC的表型為CD11b+Gr-1+，分兩個亞型：粒細胞樣的MDSC(CD11b+Ly6CLy6G+)和單核細胞樣的MDSCs(CD11b+Ly6C+Ly6G-)。一項研究顯示[21]，部分侵襲性癌癥通過單酰甘油脂肪酶(一種脂解中重要的酶)的增加而與增加的游離脂肪酸(nonestesterified fatty acid，FFA)之間產生密切關聯。另外，一些其他脂類(甘油二酯和神經酰胺)可作為次信使參與細胞生長、存活的信號傳導通路，如磷脂酰肌醇-3激酶傳導通路。MDSC主要通過產生精氨酸酶1(arginase-1，Arg-1)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase， iNOS)和 活 性 氧 (reactive oxygen，ROS)發揮免疫抑制功能。本研究顯示免疫細胞群中MDSC細胞頻率顯著增加，這也與之相一致。

圖9 流式細胞術檢測Apo C3轉基因小鼠脾臟NKT和γδ T細胞的頻率

圖10 流式細胞術檢測Apo C3轉基因小鼠脾臟B細胞的頻率

圖11 流式細胞術檢測Apo C3轉基因小鼠脾臟巨噬細胞的頻率

圖12 流式細胞術分析CD8+T細胞CD107a表達

綜上所述，本研究初步探討了Apo C3轉基因小鼠的脾臟免疫細胞表型及活性分析，結果發現Apo C3轉基因小鼠脾臟CD8+T細胞頻率及活性顯著增強，但NK細胞頻率及功能減弱，MDSC細胞頻率增強。已有研究報道，Apo C3轉基因小鼠導致的高甘油三酯血癥與痛風、糖尿病、癌癥等有關，這為疾病診療發展與免疫功能的機制研究提供了一定的依據。雖然高甘油三酯血癥與多種疾病有關，但是這些變化的脾臟細胞與Apo C3轉基因小鼠在脂質代謝、癌癥發病之間有著怎樣的關聯？這群變化的免疫細胞究竟發揮了怎樣的免疫調節功能，是否參與了脂質代謝、癌癥發病的免疫作用，這些機制仍需后續實驗來進一步討論。