多功能非病毒載體在腫瘤基因治療中的應(yīng)用

肖 月，李格非，劉 丹，陳 婷，林桂淼*

(深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東 深圳 518060)

傳統(tǒng)的腫瘤治療方式包括手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、放射性治療，這些治療方式并不能有效地阻止腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，并且由于化療的耐藥性、放療的副作用，使得它們的療效受到限制。而基因治療的興起為癌癥治療帶來(lái)了新的希望，其核心技術(shù)在于運(yùn)用載體將治療基因遞送到患者的細(xì)胞中，通過(guò)替代突變基因、敲除異常表達(dá)基因或補(bǔ)充缺失基因，從而達(dá)到精準(zhǔn)且靶向的治療目的。

在1990年，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒將腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)基因轉(zhuǎn)移到具有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)的兩個(gè)兒童的T細(xì)胞中，這是基因治療第一次應(yīng)用于臨床試驗(yàn)[1]。在這之后的20年里，全世界已經(jīng)批準(zhǔn)了1700多個(gè)關(guān)于基因治療的臨床試驗(yàn)[2]。用于臨床試驗(yàn)的載體主要分為病毒載體與非病毒載體。但病毒載體存在的安全問(wèn)題限制了它的應(yīng)用，臨床試驗(yàn)中首例死亡案例正是與腺病毒載體所帶來(lái)的嚴(yán)重免疫反應(yīng)有關(guān)[3]。與之相比，非病毒載體具有更加優(yōu)越的安全性，且易于制備，可攜帶大量核酸，但其缺點(diǎn)在于轉(zhuǎn)染效率低下，基因表達(dá)的持續(xù)時(shí)間短。

傳統(tǒng)的非病毒載體包括物理載體及化學(xué)載體，物理遞送方式包括直接注射裸DNA、電穿孔、基因槍、聲孔效應(yīng)、流體動(dòng)力基因轉(zhuǎn)移等。但這些治療方式并不能有效的保護(hù)基因不被核酸酶降解。化學(xué)載體包括無(wú)機(jī)納米顆粒(二氧化硅、磁性納米粒子、磷酸鈣、金納米粒子、碳納米粒子、量子點(diǎn)等)、陽(yáng)離子聚合物、脂質(zhì)體等。這些載體易于被化學(xué)基團(tuán)包裝修飾，從而克服將基因遞送入核的層層障礙[4]。但是，早期的非病毒載體存在作用單一、靶向性差、轉(zhuǎn)染效率低且無(wú)法示蹤等缺點(diǎn)，以至不能達(dá)到很好的治療效果。為此，近年來(lái)，人們發(fā)展了一系列多功能病毒載體。

1 多功能非病毒載體概述

多功能非病毒載體是在傳統(tǒng)非病毒載體的基礎(chǔ)上研發(fā)出的一系列具有多項(xiàng)功能的非病毒載體遞送系統(tǒng)。它將多種功能整合于同一個(gè)非病毒載體中，使之能同時(shí)實(shí)現(xiàn)靶向、成像、示蹤、光熱療、載藥或可控釋藥等。例如Kogure等[5]設(shè)計(jì)了多功能包絡(luò)型納米器件(multifunctional envelope-type nano device，MEND)，這種MEND可以通過(guò)層層包裝，在特定時(shí)點(diǎn)執(zhí)行特定的功能，從而實(shí)現(xiàn)將基因遞送入核的屏障。它們可以通過(guò)表面官能化來(lái)減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取、逃逸細(xì)胞的內(nèi)吞作用、保護(hù)核酸免于過(guò)早降解、添加配體以靶向到達(dá)腫瘤部位[6]。

此外，一些無(wú)機(jī)納米粒子也可以利用其自身材料特性，發(fā)展為多功能載體。例如磁性納米顆粒可以作為磁共振成像的造影劑；金納米顆粒可以產(chǎn)生光熱效應(yīng)；量子點(diǎn)顆粒可以進(jìn)行示蹤成像；還有些納米顆粒可同時(shí)搭載藥物與基因。對(duì)這些特殊的材料進(jìn)行包裝，不僅能有效的將基因藥物遞送入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)能通過(guò)外部干擾達(dá)到最佳的抑癌作用。如今發(fā)展的“組合”納米醫(yī)學(xué)，將多功能非病毒載體運(yùn)用于化學(xué)藥物的遞送，已在癌癥治療中進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)能夠有效減少腫瘤細(xì)胞的耐藥性及化療藥物的副作用[7]。雖然，多功能非病毒載體在運(yùn)載基因中的應(yīng)用不如化學(xué)藥物成熟，但是也處于快速發(fā)展中。

目前，多功能非病毒載體在腫瘤基因治療領(lǐng)域涵蓋了影像導(dǎo)向基因治療、光熱驅(qū)動(dòng)基因治療和聯(lián)合藥物基因治療等。

2 多功能非病毒載體的應(yīng)用

2.1 影像導(dǎo)向基因治療

影像導(dǎo)向基因治療，是指非病毒載體既可以進(jìn)行影像成像，又可以進(jìn)行基因運(yùn)載，在醫(yī)學(xué)影像導(dǎo)向作用下實(shí)現(xiàn)腫瘤的基因治療。影像導(dǎo)向基因治療的多功能非病毒載體以磁性納米顆粒最為常見(jiàn)。磁性納米顆粒是指具有磁性的鐵、鎳、鈷等材料合成的納米顆粒，它們可在臨床實(shí)踐中被用作磁共振成像(MRI)的對(duì)比增強(qiáng)劑。以氧化鐵為核心材料合成的超順磁性氧化鐵納米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中作用廣泛[8]。使用磁性納米顆粒作為遞送基因的載體可以通過(guò)多種方式提高癌癥治療的有效性。首先，磁性納米顆粒可作為造影劑用于MRI監(jiān)測(cè)并定量測(cè)定其在體內(nèi)的分布情況，這有利于控制藥物劑量。第二，通過(guò)成像作用可以對(duì)療效進(jìn)行評(píng)估。第三，磁性納米材料通過(guò)影像導(dǎo)向作用可以靶向于腫瘤的特異位點(diǎn)，從而提高了治療的選擇性，減小副作用，降低治療成本。同時(shí)，利用磁場(chǎng)驅(qū)動(dòng)是一種非侵入性的治療方式[9]。

Wu等[10]運(yùn)用了SPION運(yùn)載siRNA治療肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，用聚乙二醇(PEG)連接聚乙烯亞胺(PEI)對(duì)SPIONs進(jìn)行官能化修飾，并連接三肽精氨酸甘氨酸天冬氨酸(RGD)從而使siRNA能夠靶向且高效地到達(dá)HCC細(xì)胞中，SPION可作為體外和體內(nèi)成像的MRI探針，對(duì)此遞送系統(tǒng)的治療效果進(jìn)行了評(píng)估。同樣針對(duì)HCC，Guo等[11]利用葉酸靶向遞送系統(tǒng)Fa-PEG-g-PEI-SPION/p siRNA-TBLR有效地使人類HCC細(xì)胞系中的TBLR1基因沉默，從而抑制HCC細(xì)胞增殖及血管生成。該遞送系統(tǒng)因包含SPION，對(duì)于MRI檢測(cè)具有高靈敏度，使其可以運(yùn)用MRI技術(shù)輕松追蹤載體的遞送途徑。

除HCC以外，影像導(dǎo)向基因治療還廣泛應(yīng)用在其他類型的癌癥研究中。Gd-NGO/Let-7g/EPI遞送系統(tǒng)通過(guò)對(duì)釓(Gd)官能化修飾，將miRNA遞送至人類膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞，同時(shí)可作為造影劑幫助確定血腦屏障的開放位置和開放程度，以便精準(zhǔn)計(jì)算藥量[12]。Lin等[13]運(yùn)用SPION通過(guò)MRI導(dǎo)向?qū)iRNA遞送入人乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞，以克服多藥耐藥性乳腺癌。Fe3O4@SiO2(FITC)PEI-FA/Notch-1 shRNA遞送系統(tǒng)能夠高效率將Notch-1 shRNA遞送入人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，同時(shí)有效保護(hù)shRNA免受外源性DNaseI和核酸酶的降解。磁共振成像和熒光成像顯示癌細(xì)胞能優(yōu)先吸收此納米復(fù)合物[14]。此外，影像導(dǎo)向基因治療還可應(yīng)用于肺腺癌[15]、鼻咽癌[16]的治療研究。

在眾多研究應(yīng)用中，我們發(fā)現(xiàn)SPIONs等磁性示蹤載體材料在血液中代謝過(guò)快，具有不穩(wěn)定性，這些缺點(diǎn)限制著其在臨床上作為影像導(dǎo)向多功能非病毒載體的實(shí)用性，但將基因治療與成像示蹤技術(shù)結(jié)合在一起，為非病毒載體在腫瘤基因治療應(yīng)用上提供了一種新思路，通過(guò)實(shí)時(shí)成像有利于觀察治療基因在體內(nèi)的分布以及腫瘤對(duì)治療基因的反應(yīng)，便于及時(shí)調(diào)整治療方案等，這對(duì)臨床腫瘤的診斷與治療有著不可估量的價(jià)值。

2.2 光熱驅(qū)動(dòng)基因治療

光熱驅(qū)動(dòng)基因治療也是近年發(fā)展起來(lái)的一種新的基因治療策略，是通過(guò)在組織中誘導(dǎo)熱療殺死癌細(xì)胞并協(xié)同基因治療的一種新方法。傳統(tǒng)的熱療通常是侵入性的，容易造成非特異性的細(xì)胞損傷。如今開發(fā)出的金納米材料(AuNs)具有獨(dú)特的光熱性能，能夠在近紅外光(NIR)的照射下，將光能轉(zhuǎn)化為熱能，并且具有穩(wěn)定性、良好的生物相容性和易于制備等優(yōu)點(diǎn)[17]。運(yùn)用此類載體將治療基因遞送入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)在外部近紅外光的照射下，對(duì)腫瘤部位進(jìn)行非侵入性的光熱療法，從而達(dá)到更加有效的抑癌作用。

很多非病毒載體都可以用于光熱驅(qū)動(dòng)基因治療，如金納米棒(AuNRs)。Shen等[18]利用AuNRs作為siRNA的載體，在其表面運(yùn)用PEI逐層組裝修飾，使MDA-MB-231和SUM-159乳腺癌細(xì)胞系中的丙酮酸激酶同工酶M2(PKM2)表達(dá)下調(diào)。并在轉(zhuǎn)染后用NIR照射AuNRs，在近紅外輻射下，激發(fā)的帶電粒子衰減到周圍的介質(zhì)中，產(chǎn)生熱量，腫瘤細(xì)胞對(duì)熱敏感，從而得以將基因治療與光熱療法相結(jié)合，達(dá)到理想的抑癌作用。此外，利用殼聚糖-金納米棒(Chit-Au NRs)遞送系統(tǒng)可對(duì)三陰性乳腺癌同時(shí)進(jìn)行基因沉默和光熱消融治療[19]。使用載有多西他賽(DTX)和p65 siRNA的金納米棒能有效治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌，抑制癌細(xì)胞的增殖和肺轉(zhuǎn)移[20]。

除金納米材料以外，能進(jìn)行光熱療法的還有氧化石墨烯(GO)、單壁碳納米管(SWNT)等。Yin等[21]將氧化石墨烯聚乙二醇化，有效遞送HDAC1和K-Ras siRNA進(jìn)入胰腺癌細(xì)胞MIAPaCa-2內(nèi)，實(shí)現(xiàn)雙重基因沉默效應(yīng)并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)聯(lián)合使用NIR光熱療法抑制體內(nèi)腫瘤體積增長(zhǎng)>80%。運(yùn)用功能化的單壁碳納米管遞送系統(tǒng)SWNT-PEI/siRNA/NGR作用于PC-3人前列腺癌細(xì)胞，基因沉默和NIR光熱療法的組合顯著提高了治療效果[22]。

碳納米材料與金納米材料都能有效地運(yùn)載基因并介導(dǎo)NIR光熱療法。但是，仍有許多尚未解決的問(wèn)題限制其臨床應(yīng)用。例如，劑量依賴性及細(xì)胞毒性，雖然材料本身可被認(rèn)為無(wú)毒，但其修飾基團(tuán)或降解產(chǎn)物仍然可能產(chǎn)生毒性。

2.3 聯(lián)合藥物基因治療

由于腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性以及化療藥物帶來(lái)的不良反應(yīng)，傳統(tǒng)化療藥物的抑癌作用非常局限。因此，基因與藥物的聯(lián)合遞送系統(tǒng)近來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注。將基因療法與化學(xué)療法結(jié)合，可以有效降低藥物耐藥性，協(xié)同增強(qiáng)抗癌效果。這種方法的難點(diǎn)在于如何進(jìn)行共同遞送，因?yàn)楹怂崤c小分子藥物具有顯著不同的物理化學(xué)性質(zhì)[23]。能夠同時(shí)攜帶基因與藥物的納米載體要求具備非免疫原性、無(wú)毒、有效濃縮和固定核酸，并能夠封裝小分子等特點(diǎn)[24]。

Zheng等[25]應(yīng)用 PEI修飾的新型 TPGS-b-(PCL-ran-PGA)納米粒子同時(shí)遞送腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)和內(nèi)皮抑素至HeLa細(xì)胞中，內(nèi)皮抑素可以有效抑制血管生成，兩者協(xié)同產(chǎn)生抗癌作用，使針對(duì)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性顯著增加。Xiong等[26]基于β-環(huán)糊精共軛多聚賴氨酸(PLCD)與透明質(zhì)酸共同遞送靶向肝細(xì)胞癌(HCC)的基因和化療藥物，設(shè)計(jì)出了具有核-殼結(jié)構(gòu)的新型超分子納米粒子系統(tǒng)。該納米顆粒可以通過(guò)CD44受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用有效地將多柔比星(DOX)和oligo RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到HCC細(xì)胞中，顯著抑制細(xì)胞增殖。Reddy等[27]設(shè)計(jì)了pH敏感脂質(zhì)體納米載體用于同時(shí)遞送紫杉醇和Bcl-2 siRNA，該多功能載體可以對(duì)黑色素瘤進(jìn)行協(xié)同治療，以減少化療的耐藥性。此外，聯(lián)合藥物基因治療還廣泛應(yīng)用于膠質(zhì)細(xì)胞瘤[12]、非小細(xì)胞肺癌[28]、結(jié)直腸癌[29]、乳腺癌[30]等腫瘤的治療研究中。

聯(lián)合藥物基因治療將化療與基因治療結(jié)合在一起，可以揚(yáng)長(zhǎng)避短，最大效率地發(fā)揮抗腫瘤的作用。通過(guò)減少藥量從而減小對(duì)正常組織的損害及不良反應(yīng)。并且由于靶向遞送，使得藥物強(qiáng)有效的針對(duì)腫瘤，從而進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤效果。盡管聯(lián)合治療具有很大的優(yōu)勢(shì)，但將藥物與基因在單一載體中有效的共同轉(zhuǎn)運(yùn)用于癌癥治療仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。本文對(duì)多功能非病毒載體在腫瘤基因治療中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)，見(jiàn)表1。

表1 多功能非病毒載體在腫瘤基因治療中的應(yīng)用

3 應(yīng)用前景

將具有不同功能的元件組合成單個(gè)遞送系統(tǒng)用于運(yùn)載核酸，是一個(gè)具有潛力的策略，但方法仍然面臨多種困境。包括“聚陽(yáng)離子困境”、“PEG困境”、“包裝與釋放困境”[31]，針對(duì)這些困境，人們也研究出了許多解決方案，例如增加或改變載體的表面涂層，輕微調(diào)整載體的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。

但若想將多功能載體應(yīng)用于臨床，需要更加精確的評(píng)估載體的尺寸、表面特性及用于診斷與治療的劑量，同時(shí)需要減小修飾其表面的化學(xué)官能團(tuán)的細(xì)胞毒性，提高其生物相容性。從而得到一個(gè)理想方案，即得到一種遞送系統(tǒng)，能夠有高效的轉(zhuǎn)染效率、低生物毒性、劑量可控、并能穩(wěn)定且精準(zhǔn)的到達(dá)腫瘤部位。

同時(shí)，我們更希望研究出能夠發(fā)揮多項(xiàng)功能的載體材料，其不僅能夠作為MRI的造影劑，且能在近紅外光的照射下將光能轉(zhuǎn)化為熱能，同時(shí)能夠穩(wěn)定的聯(lián)合運(yùn)載基因與藥物等，以期待其在臨床應(yīng)用中達(dá)到最佳的抑癌作用。