端粒蛋白復(fù)合物shelterin的結(jié)構(gòu)及功能研究進(jìn)展

王 晗，倪 娟，2，薛京倫，汪 旭，2，*

(1．云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500；2．云南師范大學(xué)生物能源持續(xù)開發(fā)與利用教育部工程研究中心，云南昆明 650500；3．復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433)

端粒(telomere)位于真核生物線性染色體末端，是穩(wěn)固真核生物染色體、保護(hù)遺傳信息完整的必要組分。端粒長度的調(diào)節(jié)對維持端粒結(jié)構(gòu)及功能的穩(wěn)定至關(guān)重要，也在維護(hù)染色體末端的完整性及穩(wěn)定性方面起重要作用[1]。端粒縮短與衰老相關(guān)，而當(dāng)細(xì)胞在端粒極短時繼續(xù)存活，則會引起端粒結(jié)構(gòu)和功能紊亂，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性發(fā)生，增加疾病發(fā)生風(fēng)險[2]。目前，端粒長度已成為退行性疾病如心血管疾病、阿爾茲海默癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的重要生物指標(biāo)[3]。端粒酶(telomerase)、端粒蛋白復(fù)合物(shelterin)以及眾多與端粒相互作用的因子，均參與調(diào)控端粒長度。任何端粒相關(guān)蛋白因子表達(dá)改變均與端粒功能失調(diào)、細(xì)胞衰老加速相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性以及疾病的發(fā)生和發(fā)展[4]。

其中，shelterin復(fù)合物對端粒結(jié)構(gòu)及功能的重要維護(hù)作用逐漸凸顯。近年來研究發(fā)現(xiàn)，shelterin復(fù)合物表達(dá)異常、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變或發(fā)生基因突變，容易引起端粒脫帽、端粒長度改變，對端粒結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響，易引起染色體末端融合、基因組穩(wěn)定性下降等惡性事件的發(fā)展，與疾病發(fā)生密切相關(guān)。Shelterin復(fù)合物各組分的結(jié)構(gòu)及其端粒維護(hù)功能甚至非端粒功能的研究，對端粒生物學(xué)、端粒相關(guān)的退行性疾病研究均具有重要意義，也在癌癥早期診斷、干預(yù)和治療過程中具有潛在作用。本文對shelterin復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和各組分的功能研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 端粒蛋白復(fù)合物shelterin

在結(jié)構(gòu)上，端粒序列由雙鏈DNA區(qū)和一個富含G的3′端懸突即單鏈DNA區(qū)組成。Shelterin復(fù)合物可通過與端粒特異性結(jié)合，使端粒末端類似DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break，DSB)結(jié)構(gòu)形成端粒環(huán)(telomere-loop，T-loop)，幫助端粒成帽，保護(hù)染色體末端免遭DSB識別，抑制DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response，DDR)，維護(hù)端粒結(jié)構(gòu)和功能完整，保護(hù)染色體末端穩(wěn)定[5]。人的shelterin復(fù)合物由6種核心蛋白質(zhì)組成：端粒重復(fù)結(jié)合因子1和2(telomeric repeat-binding factors 1 and 2，TRF1，TRF2)，TRF1相互作用蛋白 2(TERF 1-interacting protein 2，TIN2)，TRF2相互作用蛋白1(TRF2-interacting protein 1，RAP1)，端粒保護(hù)蛋白1(protection of telomeres 1，POT1)以及POT1結(jié)合蛋白1(telomere-binding protein POT1-interacting protein 1，TPP1)[6]。其中，TRF1 和TRF2與端粒雙鏈DNA結(jié)合；TPP1與POT1結(jié)合后募集POT1到端粒區(qū)；POT1可特異性識別端粒單鏈DNA；RAP1通過與TRF2相互作用定位到端粒；最后，TIN2起到橋梁作用將POT1-TPP1與TRF1、TRF2連接，從而將整個shelterin復(fù)合物結(jié)合到一起，穩(wěn)定端粒結(jié)構(gòu)(圖1所示)。

Shelterin復(fù)合物可抑制端粒區(qū)包括ATM和ATR信號傳導(dǎo)、非同源末端連接、同源重組等介導(dǎo)的DNA損傷信號通路及DNA修復(fù)途徑激活，并通過螯合端粒3′端懸突來阻止外切核酸酶對端粒區(qū)的降解，它還可通過影響端粒酶到達(dá)端粒區(qū)的進(jìn)程來調(diào)控端粒長度[8]。Shelterin復(fù)合物完成對端粒穩(wěn)定維護(hù)的前提，必須是shelterin各組分的結(jié)構(gòu)和功能完整。

2 TRF1和TRF2

圖1 端粒與shelterin復(fù)合物[7]

Shelterin的兩個亞基TRF1和TRF2均具有對端粒雙鏈DNA特異性結(jié)合的C端Myb-SANT DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域和二聚化結(jié)構(gòu)域，TRF2還具有RAP1結(jié)合基序[9]。TRF1和TRF2必須先構(gòu)成同源二聚體，才能與端粒序列緊密結(jié)合。TRF2具有拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，可幫助端粒3′端懸突插入雙鏈DNA中形成T-loop，有效隱藏了端粒末端，它還負(fù)責(zé)端粒成帽，對保護(hù)端粒完整性至關(guān)重要[10]。

研究發(fā)現(xiàn)，TRF1最主要的作用是負(fù)向調(diào)控端粒長度[11]，并參與端粒DNA復(fù)制[12]。TRF1刪除會阻止ATM-TRF1相互作用，阻礙P53和CHK2募集，使DNA損傷區(qū)域的復(fù)制叉繼續(xù)前進(jìn)，最終導(dǎo)致細(xì)胞分裂異常和基因組不穩(wěn)定[13]。而TRF2可正向調(diào)控端粒長度，TRF2同源二聚體結(jié)構(gòu)還可特異性抑制端粒區(qū)ATM依賴的DNA損傷信號，這個結(jié)構(gòu)是許多修復(fù)蛋白如Apollo、SLX4、RTEL1的結(jié)合中心，TRF2的表達(dá)減少可激活端粒區(qū)ATM激酶通路，導(dǎo)致非同源末端連接引起的端粒融合[10，14-15]。端粒鋅指相關(guān)蛋白(telomeric zinc finger-associated protein，TZAP)可與TRF2競爭結(jié)合到端粒區(qū)來調(diào)控端粒長度，開啟并觸發(fā)端粒修剪(telomere trimming)，設(shè)定端粒長度上限，維護(hù)基因組穩(wěn)定，但在TRF2過表達(dá)的細(xì)胞中定位到端粒區(qū)的TZAP會大大降低，說明TRF2過表達(dá)會取代TZAP的位置[16]。

細(xì)胞中TRF1和TRF2表達(dá)改變在癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中出現(xiàn)。Diehl等[17]發(fā)現(xiàn)，TRF2表達(dá)下降引起端粒縮短，促使乳腺癌惡化。Pal等[18]發(fā)現(xiàn)，在腎細(xì)胞癌中，TRF1和TRF2的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均呈高表達(dá)狀態(tài)，而沉默TRF1和TRF2可引起腎癌細(xì)胞A498細(xì)胞周期阻滯，凋亡發(fā)生。TRF1和TRF2的表達(dá)狀況可能在腫瘤早期診斷中成為指標(biāo)。

3 POT1和TPP1

POT1可高特異性、高親和性結(jié)合端粒單鏈DNA，在端粒區(qū)，POT1與TPP1會形成異源二聚體，并依賴POT1的寡核苷酸結(jié)合折疊(OB-fold)結(jié)構(gòu)域結(jié)合到端粒3′端，阻止復(fù)制蛋白的募集，抑制端粒區(qū)類似DNA雙鏈損傷的激活[19]。人POT1有3個OB-fold結(jié)構(gòu)域，它們負(fù)責(zé)與端粒DNA結(jié)合，并對POT1與TPP1相互作用構(gòu)成緊密的異源二聚體非常重要。TPP1與POT1的結(jié)合，可提高POT1與單鏈DNA的緊密程度，促進(jìn)POT1與端粒區(qū)單鏈DNA結(jié)合，保護(hù)染色體末端穩(wěn)定[20]。TPP1的N端OB-fold結(jié)構(gòu)域還可與端粒酶重要組分TERT相互作用，將端粒酶募集到染色體末端，并且與POT1一起增加端粒酶延伸活性，調(diào)節(jié)端粒長度[21]。

POT1還是癌癥中最常見的突變型shelterin組分。由于POT1抑制DNA損傷信號傳導(dǎo)和修復(fù)激活的能力均需要OB-fold的參與，所以有研究認(rèn)為OB-fold突變促進(jìn)了基因組不穩(wěn)定性且可引發(fā)腫瘤[22]。Chen等[23]發(fā)現(xiàn)POT1 C端的A364E、P371T、E572K等突變位點(diǎn)可破壞POT1與TPP1結(jié)合，引起POT1蛋白改變，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性增加。Rice等[19]也發(fā)現(xiàn)POT1 C端的P446Q、C591W、Q623H等位點(diǎn)突變可擾亂POT1的C端折疊，或破壞POT1-TPP1結(jié)合及POT1-TPP1與端粒的親和力，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定并促進(jìn)如黑色素瘤等癌癥發(fā)生。

除基因突變外，POT1或TPP1刪除或表達(dá)改變，同樣與疾病產(chǎn)生相關(guān)。Qiang等[24]發(fā)現(xiàn)在利用ALT延長端粒的U2OS細(xì)胞中，TPP1刪除導(dǎo)致端粒縮短、凋亡發(fā)生和細(xì)胞輻射敏感性增強(qiáng)。Ahmad等[25]在吸煙者、肺氣腫和慢阻肺病患者中發(fā)現(xiàn)TPP1表達(dá)降低，并伴隨持續(xù)的端粒DNA損傷和細(xì)胞衰老，他們發(fā)現(xiàn)吸煙會破壞TPP1與去乙酰化酶的相互作用，導(dǎo)致TPP1乙酰化和蛋白降解增加。

4 TIN2

TIN2是POT1-TPP1復(fù)合物與TRF1、TRF2相連接的橋梁，也起到穩(wěn)定TRF1、TRF2與雙鏈DNA連接的作用。研究發(fā)現(xiàn)，TIN2的異常會引起shelterin復(fù)合物不能完整組裝并緊密結(jié)合到端粒區(qū)。先天性角化不良(dyskeratosis congenita，DC)患者的統(tǒng)一特征是端粒異常縮短，F(xiàn)rescas等[26]研究證實攜帶TIN2突變的DC患者將具有更短的端粒且伴隨有疾病加重的現(xiàn)象。Chen等[27]在TIN2敲除的細(xì)胞中也觀察到TRF2功能的降低，在TIN2敲除的細(xì)胞中，過表達(dá)TRF2并不能完全抑制ATM激酶信號通路的激活，TRF2突變引起TIN2結(jié)合的改變也會引起ATM信號通路的部分激活。

除TIN2的端粒功能外，近幾年有研究發(fā)現(xiàn)了TIN2的非端粒功能。Sullivan等[28]發(fā)現(xiàn)，定位于線粒體的TIN2可減少ATP的產(chǎn)生并增加ROS的生成，而線粒體長期缺失TIN2會導(dǎo)致細(xì)胞代謝增殖加速，引起細(xì)胞增殖的異常，易誘導(dǎo)細(xì)胞癌變。

5 RPA1

抑制因子激活蛋白1(repressor/activator protein 1，RAP1)，是shelterin中保守度最高的組分。人RAP1包含4個蛋白質(zhì)相互作用域：N末端的BRCT結(jié)構(gòu)域，兩個中心Myb結(jié)構(gòu)域以及C末端的RPA1蛋白相互作用即RCT結(jié)構(gòu)域，其中，RCT結(jié)構(gòu)域在RAP1與TRF2的相互作用中起關(guān)鍵作用[29]。RAP1通過與TRF2相互作用結(jié)合到端粒序列上，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，但其對端粒成帽卻是一個非必須蛋白[30]。即使如此，RAP1和TRF2之間的相互作用對端粒功能和染色體末端維護(hù)仍然重要[29]。Kabir等[31]發(fā)現(xiàn)在沒有Ku 70/80的情況下，RAP1-TRF2復(fù)合物可有效抑制染色體末端的同源性修復(fù)。Benarroch等[32]也發(fā)現(xiàn)在端粒保護(hù)機(jī)制受損時，端粒區(qū)RAP1可作為防止非同源末端連接的備用機(jī)制，保護(hù)端粒末端穩(wěn)定。RAP1表達(dá)還與腎細(xì)胞癌相關(guān)[33]，RAP1通過其端粒相關(guān)作用穩(wěn)固端粒結(jié)構(gòu)，RAP1表達(dá)改變同樣可導(dǎo)致疾病發(fā)生。

6 展望

端粒結(jié)構(gòu)和功能完整對基因組穩(wěn)定性維持起重要作用，端粒異常與基因組不穩(wěn)定性相關(guān)，容易增加疾病風(fēng)險。大量研究已證實，shelterin復(fù)合物起到維持端粒穩(wěn)定和調(diào)控端粒酶進(jìn)程的重要作用，因shelterin復(fù)合物表達(dá)異常或結(jié)構(gòu)改變引起端粒功能失調(diào)可推動癌癥發(fā)生、發(fā)展。目前，已發(fā)現(xiàn)通過抑制TRF1來誘導(dǎo)癌細(xì)胞端粒脫帽，進(jìn)而引起端粒損傷以及細(xì)胞死亡，可將TRF1作為肺癌治療潛在靶點(diǎn)，同時，多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)TRF2、TPP1表達(dá)上調(diào)，也突出shelterin成員有希望作癌癥早期診斷、干預(yù)和治療的潛在靶點(diǎn)[34]，而檢測POT1的N端及C端突變位點(diǎn)也可在預(yù)防和治療癌癥中起到關(guān)鍵作用。任何shelterin復(fù)合物組分發(fā)生表達(dá)、結(jié)構(gòu)改變，都將影響整個shelterin復(fù)合物與端粒區(qū)的穩(wěn)定結(jié)合，因此shelterin組分精細(xì)結(jié)構(gòu)及特定功能的全面深入研究，對清晰解讀端粒生物學(xué)、預(yù)防和治療癌癥等方面將有極大的促進(jìn)作用。