纈草萜內酯對體外誘導肝星狀細胞增殖及氧化應激反應的影響

梁 群，邢金梅，何學斌

（1.浙江省杭州市大江東醫院，浙江 杭州 311225；2.河北省保定市第二醫院，河北 保定 071000；3.華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院，湖北 武漢 430000）

纈草為敗醬科的1種耐寒可開花植物，種類復雜繁多，主要分布于溫帶地區，在我國主要產于東北至西南的廣大地區，大約有30種，作為1種傳統草藥材，早在古希臘時期就被人所認識，而在我國明代也有其使用記錄。纈草入藥部位主要為根和莖，其提取物中含有單萜、倍半萜、環烯醚萜、揮發油、生物堿等多種成分，具有抗焦慮［1］、抗抑郁［2］、治療失眠［3］、抗腫瘤［4-5］、保肝［6］、護腎［7］等藥理作用，但目前相關制劑的開發利用較少。

課題組前期采用纈草環烯醚萜所用的TLC、HPLC 法（英國藥典、外文文獻推薦）來檢測國產纈草（采自神農架、鄂西北、鄂西南、陜南、川東、湘西、黔東南、新疆），雖然未發現環烯醚萜類纈草的標志性成分——纈草三酯和異纈草三酯，但發現了另外3種含有量相當高的物質，經過提取、分離、純化，并經波譜分析鑒定結構，三者異羥肟酸鐵反應呈陽性，提示為內酯類物質，暫命名為纈草萜內酯A、B、C。初步研究顯示，纈草浸膏對 CCl4誘導的大鼠肝硬化有一定防治作用，而以上3種成分為其中的主要成分，故推測纈草萜內酯對肝纖維化也可能有一定的防治作用。目前，尚無關于纈草萜內酯體外抗肝纖維化作用的報道，故本研究探討該成分對體外誘導肝星狀細胞增殖及氧化應激反應的影響，并考察其對肝纖維化的保護作用及其機制。

1 材料

1.1 細胞 大鼠HSC-T6 細胞株，由上海中醫藥大學肝病研究所饋贈。

1.2 試劑 南美胎牛血清（批號 SV30087.02，美國HyClone 公司）；DMEM 培養基［賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司］；枸櫞酸鐵銨、微量丙二醛（MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）WST-1 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；次氮基三醋酸二鈉（NTA，批號N9877-5G）、四硝基偶氮唑鹽（MTT）、秋水仙素（批號C9754）、胰酶（美國 Sigma 公司）；二甲基亞砜（DMSO，北京防化研究院化工廠）。

1.3 儀器 二氧化碳培養箱（美國Thermo Forma 公司，型號55651-950）；熒光倒置顯微鏡（日本 Nikon 公司，型號TE2000-S）；酶聯免疫檢測儀（香港基因有限公司，型號MX200）；臺式自動平衡離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司，型號TDZ4-WS）；精密移液器（德國 Eppendorf 公司）；水平搖床（沃德生物醫學儀器公司，型號 WD-9405B）。

1.4 藥物 纈草萜內酯提取物由華中科技大學同濟醫學院老年醫藥學研究所薛存寬教授提供，命名為纈草萜內酯A、B、C，含有量＞98%，復旦大學、北京師范大學分析測試中心經紫外光譜、紅外光譜、核磁共振譜、質譜、DEPT、COSY 譜鑒定其化學結構。

2 方法

2.1 HSC-T6 培養 將凍存狀態的HSC-T6 于37 ℃下快速復蘇后，接種于培養瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養液，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞長滿單層（約2 d）后胰酶消化并傳代，臺盼藍法測定細胞活力。

2.2 細胞增殖抑制實驗 取對數生長期的HSC-T6，經清洗、消化、吹打混勻后取 50 μL 懸液，加入 6 mL 含 3% 小牛血清的DMEM 培養液中稀釋，計數并調整細胞密度為1×104／mL，接種于 96 孔板，空白調零組不加細胞懸液，其余每孔100 μL，置于培養箱中培養至近單層貼壁后取出傾去培養液，分別加入稀釋細胞懸液（正常對照組）、稀釋細胞懸液＋0.1 mmol／L FeNTA（模型組）、稀釋細胞懸液＋0.1 mmol／L FeNTA＋50、100、200、300、400 μg／mL 纈草萜內酯 A、B、C（實驗組）、稀釋細胞懸液＋0.1 mmol／L FeNTA＋0.5 μg／mL 秋水仙堿（陽性對照組），平行 3 孔，繼續培養 36 h 后棄上清液，每孔加入 MTT 溶液（5 mg／mL）20 μL，37 ℃ 下繼續孵育 5 h，終止培養，離心（1 000 r／min）5 min 后吸棄孔內培養液，加入 150 μL DMSO，微量振蕩器上振蕩10 min 以使結晶物充分溶解，酶聯免疫檢測儀上在570 nm 波長處測定各孔光密度值（OD 值），平行測 3 次，記錄中位值。

2.3 抗氧化應激實驗 取對數生長期HSC-TC，清洗、消化、吹打混勻后取200 μL 懸液，加入12 mL 配制好的3%培養基中稀釋，計數并調整細胞密度為5×105／mL，接種于24 孔板，每孔500 μL，置于培養箱中培養至近單層貼壁后取出，傾去培養液，加入稀釋細胞懸液（正常對照組）、稀釋細胞懸液＋0.1 mmol／L FeNTA（模型組）、稀釋細胞懸液＋0.1 mmol／L FeNTA＋50、200、400 μg／mL 纈草萜內酯A、B、C（實驗組）、稀釋細胞懸液＋0.1 mmol／L FeNTA＋50 μmol／L 維生素 E（陽性對照組），每孔加 200 μL 含藥培養液，平行2 孔，繼續培養36 h 后取上清液，按試劑盒說明書操作步驟檢測上清液中SOD、MDA 水平。

2.4 統計學分析 通過SPSS 16.0 軟件進行處理，數據用（）表示，組間比較采用單因素方差分析和 SNK-q 檢驗。P＜0.05 差異有統計學意義。

3 結果

3.1 細胞活力 0.5%臺盼藍染色測定，細胞活力＞90%。

3.2 纈草萜內酯 A、B、C 對 HSC-T6 增殖的影響 表1顯示，與正常對照組比較，模型組 HSC-T6 增殖明顯（P＜0.01）；與模型組比較，纈草萜內酯 A、B、C 組 OD 值顯著降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性。

3.3 纈草萜內酯 A、B、C 對 SOD 活性、MDA 水平的影響 表2顯示，與模型組比較，纈草萜內酯 A、B、C 組 SOD活性顯著升高（P＜0.05，P＜0.01，50 μg／mL 纈草萜內酯 A、B 除外），并呈現劑量依賴性；與陽性對照組比較，纈草萜內酯 C 400 μg／mL 組其活性顯著升高（P＜0.01）。

表3顯示，與模型組比較，纈草萜內酯 A、B、C 組MDA 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，50 μg／mL 纈草萜內酯A、B 除外），并呈劑量依賴性；與陽性對照組比較，纈草萜內酯 C 400 μg／mL 組其水平顯著降低（P＜0.05）。

表1 纈草萜內酯A、B、C 對HSC-T6 增殖的影響（）

表1 纈草萜內酯A、B、C 對HSC-T6 增殖的影響（）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01

組別OD 值纈草萜內酯A 纈草萜內酯B 纈草萜內酯C正常對照組 0.359 0±0.015 2 0.359 0±0.015 2 0.359 0±0.015 2模型組 0.869 5±0.015 3△△ 0.869 5±0.015 3△△ 0.869 5±0.015 3△△陽性對照組 0.634 3±0.017 4 0.634 3±0.017 4 0.634 3±0.017 4 400 μg／mL 組 0.568 9±0.009 6?? 0.482 1±0.008 3?? 0.418 1±0.005 7??300 μg／mL 組 0.614 6±0.018 3?? 0.563 1±0.014 8?? 0.494 3±0.015 6??200 μg／mL 組 0.701 0±0.018 1?? 0.665 8±0.015 3?? 0.603 7±0.022 5??100 μg／mL 組 0.850 9±0.024 9 0.750 5±0.014 3?? 0.694 0±0.023 7??50 μg／mL 組 0.861 3±0.021 8 0.856 2±0.022 6 0.782 5±0.008 2??

表2 纈草萜內酯A、B、C 對SOD 活性的影響

表3 纈草萜內酯A、B、C 對HSC-T6 培養液中MDA 水平的影響

4 討論

肝纖維化是慢性肝臟疾病進展過程中的1 個必經環節，為所有慢性肝病的共同病理基礎，其本質是肝組織對損傷發生的過度修復應答，導致瘢痕組織形成的病理過程，各種病因（病毒感染、酒精中毒、金屬超負荷等）引起肝臟損傷的病理過程不同，但其所致肝纖維化的最終途徑是相同，即肝星狀細胞激活。大量研究表明，HSC 無論正常或病理狀態下都是產生細胞外基質的主要細胞［8-10］，本實驗所用的HSC-T6 是正常大鼠肝星狀細胞，它與人類肝星狀細胞（LX-2）在形態學特點、生長特點、標志物方面都比較接近，是肝纖維化研究的理想細胞系，再將其與FeNTA共同培養，采用鐵超負荷法來制造氧化應激的模型。劉梅等［11］應用不同質量濃度的 FeNTA 培養大鼠肝 HSC，證實鐵劑可引起后者增殖，導致氧化-抗氧化失衡；MTT 法檢測HSC 的生長及存活率是 Mosmann［12］最早報道的，該方法操作簡便，經濟快捷，靈敏度高，重復性好，廣泛用于生物因子活性的檢測，故本實驗選擇該方法。

脂質過氧化反應在調節體內膠原基因表達的過程中起著主導作用，同時也是連接組織損傷和纖維化過程的紐帶，抗氧化劑可通過作用于肝細胞、HSC、Kupffer 等多種細胞及環節來減慢或阻止肝纖維化的發展［13-14］。機體受到刺激后，引起酶和非酶系統平衡失調，導致大量氧自由基產生，后者主要攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化反應，并形成大量脂質過氧化產物，如醛基（丙二醛MDA）、酮基、氫過氧基等。MDA 作為脂質過氧化反應的中間產物，間接反映了細胞受氧自由基攻擊的嚴重程度，而其檢測常與SOD 相互配合，后者間接反映了機體清除氧自由基的能力，對機體氧化-抗氧化平衡起到重要作用，故藥物抗氧化作用越強，MDA 水平越低，SOD 活性越高。

維生素E 是1種脂溶性抗氧化劑，又名生育酚（包括α、β、γ、δ 4種類型），不但能清除 O2-·等氧自由基，也可與GPx 協同阻止脂質過氧化反應發生，同時還有抗纖維化的作用。Nieto 等［15］報道，HSC 活化后可表達細胞色素P450E1 調節ROS 產物，從而誘導 COLI 表達，而維生素 E處理過的細胞能破壞細胞色素P450E1；其他研究也發現維生素E 可降低α-SMA 表達，使膠原或四氯化碳損傷細胞中的蛋白質與MDA 形成加合物，表明它在機體抗氧化應激過程中發揮著不可或缺的作用，故本實驗選擇其作為陽性對照。

結果表明，纈草萜內酯 A（400、300、200 μg／mL）、纈草萜內酯 B（400、300、200、100 μg／mL）、纈草萜內酯C（400、300、200、100、50 μg／mL）對 HSC-T6 增殖均有一定抑制作用，并呈劑量依賴性；除50 μg／mL 纈草萜內酯A、B 外，其他不同質量濃度成分均有抗氧化作用，也呈劑量依賴性；成分質量濃度越高時，SOD 活性越高，MDA 水平越低；400 μg／mL 纈草萜內酯 C 的抗氧化作用強于50 μmol／L維生素 E。

綜上所述，纈草萜內酯可抑制肝星狀細胞增殖，并對機體氧化應激反應有一定保護作用，但該成分對肝纖維化的作用機制還有待進一步研究。