大黃蒽醌苷對大鼠腦缺血再灌注損傷及腸道菌群的影響

虞夏暉，朱雨晴，王于俊，徐義培，郭 瑩

（浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院，浙江 杭州 310053）

缺血性腦卒中即為現(xiàn)代醫(yī)學中的缺血性腦血管病，是指血管阻塞引起腦缺血、缺氧損傷進而導(dǎo)致局灶或全腦的功能障礙，具有發(fā)病率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高等特點，嚴重危害人類健康［1］。目前為止，臨床上的首要治療原則是使缺血腦組織盡早恢復(fù)或再通血液灌注，重新獲得血氧供應(yīng)，但這些治療措施在使閉塞腦血管再通的同時常使缺血組織病理損害加重甚至不可逆，臨床癥狀惡化，這種現(xiàn)象被稱為腦缺血再灌注損傷［2］。近年來研究表明，腸道菌群在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［3-4］。Benakis 等［5］報道腸道菌群可通過調(diào)節(jié)腸道 γδT 細胞，從而影響缺血性腦卒中的損傷。

大黃是我國傳統(tǒng)的四大中藥之一，具有瀉下通便、活血逐瘀等多種功效［6］，蒽醌苷作為其中主要的有效成分，對大鼠腦缺血損傷具有顯著保護作用［7］，但其防治機制尚不明確。現(xiàn)代研究表明，蒽醌苷類成分難以吸收，大多滯留于腸道發(fā)揮藥效作用［8］，大黃蒽醌苷對腦缺血性損傷的治療作用可能和其在腸道的位置有關(guān)，也有文獻形式中藥苷類成分藥效的發(fā)揮和腸道菌群的相互作用有關(guān)［9-10］。本實驗旨在研究大黃蒽醌苷對腦缺血再灌注損傷大鼠的治療效果，并比較該成分對腸道菌群的影響，探討其抗腦缺血性損傷機制與腸道菌群的相關(guān)性。

1 材料

1.1 動物 健康清潔級SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量（280±20）g，購自浙江省實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（浙）2014-0001。

1.2 試藥 藥用大黃Rheum officinaleBaill（浙江天道醫(yī)藥有限公司，批號 170302）。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、乳酸（LD）、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）；TTC 染料（美國 Sigma 公司）；伊紅美蘭培養(yǎng)基（EMB）、膽鹽-七葉苷-疊氮鈉瓊脂、雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基（BBL）、乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基（LBS）（青島海博生物科技有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器 SpectraMax M3 酶標儀（美國 MD 公司）；FA2 104N 電子分析天平（上海菁海儀器有限公司）；DRP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實驗儀器有限公司）；SW-CJ-2G 型雙人凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

2 方法

2.1 分組與給藥 乙醇回流提取法得到蒽醌粗提取物，再以70%甲醇，葡聚糖凝膠LH-20 柱色譜純化得到蒽醌苷提取物［11］，按后續(xù)實驗要求用蒸餾水將提取物配制成不同質(zhì)量濃度。大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組及大黃蒽醌苷高、中、低劑量組（30、15、7.5 m／kg），每組 9 只。大鼠腦缺血再灌注同時灌胃給藥，連續(xù) 7 d，1 次／d，假手術(shù)組、模型組大鼠灌服等量生理鹽水。

2.2 模型建立 大鼠稱定質(zhì)量后，腹腔注射10%水合氯醛（劑量 300 mg／kg）麻醉，參考 Longa 等［12］報道的方法建立大腦中動脈局灶性栓塞（MCAO）模型，假手術(shù)組大鼠不插栓線。缺血60 min 后抽出栓線，松開頸總動脈夾作再灌注，以大鼠蘇醒后出現(xiàn)同側(cè)Horner 征和對側(cè)前肢提爪為造模成功。

2.3 神經(jīng)功能評分 大鼠灌胃給藥7 d 后，參考Longa等［12］報道的5 分制評分法進行評分：無精神損傷癥狀，為0 分；不能完全伸展對側(cè)前爪，為1 分；向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，為 2分；向?qū)?cè)傾倒，為 3 分；不能自發(fā)行走，意識喪失，為4 分。

2.4 腦梗死范圍百分比測定 大鼠灌胃給藥7 d 后麻醉，斷頭取腦，生理鹽水沖洗殘血，-20 ℃下速凍20 min，置于腦槽中切片，TTC 染色，Image J 軟件測定腦梗死范圍百分比。

2.5 腦組織指標檢測 取大鼠缺血側(cè)腦組織，稱定質(zhì)量后加生理鹽水制成10%組織勻漿，3 000 r／min 離心10 min，取上清液，-20 ℃下保存。按試劑盒說明操作步驟測定腦組織中 SOD、NOS、LDH 活性及 MDA、LD、NO、IL-1β、TNF-α 水平。

2.6 腸道菌群檢測［13］分別在灌胃給藥 1、7 d 后，無菌條件下收集大鼠糞便，各組取0.1 g，置于裝有玻璃珠的無菌試管中，按1 ∶9 比例加入滅菌生理鹽水渦旋振蕩至糞便均勻化，10 倍稀釋法用生理鹽水將糞便懸液依次稀釋至10-8濃度。選用合適的稀釋液作為腸道菌群檢測液進行選擇性培養(yǎng)，取50 μL 適宜稀釋度的菌懸液接種于各選擇性培養(yǎng)基上，涂布均勻，平行3 次，大腸桿菌和腸球菌于37 ℃下培養(yǎng)24 h，雙歧桿菌、乳酸桿菌于37 ℃下厭氧培養(yǎng)48 h，以菌落形態(tài)、革蘭氏染色和生化反應(yīng)鑒定細菌，計算各平板上菌落數(shù)，結(jié)果以每1 g 糞便中菌落數(shù)的對數(shù)值表示（l g CFU／g）。

2.7 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 17.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one way ANOVA）和 LSD 檢驗。P＜0.05 表示有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大黃蒽醌苷對大鼠神經(jīng)功能評分的影響 表1顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃蒽醌苷高、中劑量組大鼠其評分顯著降低（P＜0.01）。

表1 大黃蒽醌苷對大鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死范圍百分比的影響（， n=9）

表1 大黃蒽醌苷對大鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死范圍百分比的影響（， n=9）

注：與假手術(shù)組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別 劑量／（mg·kg-1）神經(jīng)功能評分／分腦梗死范圍百分比／%假手術(shù)組 — 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 — 2.44±0.53?? 26.79±4.38??大黃蒽醌苷低劑量組 7.5 2.00±0.71 23.64±3.64大黃蒽醌苷中劑量組 15 1.50±0.85△△ 16.97±1.69△△大黃蒽醌苷高劑量組 30 1.22±0.67△△ 9.65±1.55△△

3.2 大黃蒽醌苷對大鼠腦梗死范圍百分比的影響 表1顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死范圍百分比顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃蒽醌苷高、中劑量組大鼠其百分比顯著降低（P＜0.01）。然后，大鼠斷頭取腦，TTC 染色，測定腦梗死體積，結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織TTC 染色

3.3 大黃蒽醌苷對 SOD、NOS、LDH 活性及 MDA、LD、NO、IL-1β 和 TNF-α 水平的影響 表2顯示，與假手術(shù)組比較，模型組 SOD 活性顯著降低（P＜0.01），NO、LD、MDA 水平及 NOS、LDH 活性顯著提高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃蒽醌苷高、中劑量組上述指標顯著改善（P＜0.05，P＜0.01），以高劑量組更明顯。

表2 大黃蒽醌苷對 SOD、NOS、LDH 活性及 MDA、LD、NO、IL-1β 和 TNF-α 水平的影響（， n=9）

表2 大黃蒽醌苷對 SOD、NOS、LDH 活性及 MDA、LD、NO、IL-1β 和 TNF-α 水平的影響（， n=9）

注：與假手術(shù)組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 SOD／（U·mg prot-1）MDA／（nmol·mg prot-1 ）LD／（mmol·g prot-1 ）LDH／（U·mg prot-1）NO／（μmol·g prot-1 ）NOS／（U·mg prot-1）假手術(shù)組 327.95±47.57 1.84±0.38 1.05±0.28 13.77±5.09 12.44±1.86 2.54±0.72模型組 193.92±38.10?? 4.61±1.15?? 2.03±0.49?? 23.75±3.09?? 18.08±2.92?? 3.65±0.29??大黃蒽醌苷低劑量組 220.15±22.71 4.10±1.19 2.11±0.46 23.74±2.55 15.52±1.98 3.45±0.35大黃蒽醌苷中劑量組 272.77±48.03△△ 2.34±0.70△△ 1.55±0.42 19.78±2.43 14.70±1.63△ 2.97±0.51△大黃蒽醌苷高劑量組 296.49±36.72△△ 2.03±0.48△△ 1.32±0.24△ 17.10±3.32△ 13.04±2.73△△ 2.67±0.68△△

3.4 大黃蒽醌苷對 IL-1β、TNF-α 水平的影響 表3顯示，與假手術(shù)組比較，模型組 IL-1β、TNF-α 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃蒽醌苷高、中劑量組兩者水平顯著降低（P＜0.01）。

表3 大黃蒽醌苷對IL-1β、TNF-α水平的影響（， n=9）

表3 大黃蒽醌苷對IL-1β、TNF-α水平的影響（， n=9）

注：與假手術(shù)組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別 劑量／（mg·kg-1）IL-1β／（pg·mL-1）假手術(shù)組 — 234.56±36.70 188.67±30.60模型組 — 363.33±67.47?? 280.74±54.55??大黃蒽醌苷低劑量組 7.5 320.56±55.03 226.83±42.90大黃蒽醌苷中劑量組 15 271.89±42.46△△ 202.22±27.62△△大黃蒽醌苷高劑量組 30 265.74±39.28△△ 202.41±30.94△△TNF-α／（pg·mL-1）

表4 大黃蒽醌苷對腸道菌群的影響（lgCFU／g，， n=9）

表4 大黃蒽醌苷對腸道菌群的影響（lgCFU／g，， n=9）

注：與假手術(shù)組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

時間／d 組別 大腸桿菌 腸球菌 乳酸桿菌 雙歧桿菌1假手術(shù)組 6.21±0.46 4.71±0.38 7.22±0.15 7.97±0.19模型組 7.78±0.23?? 6.82±0.26?? 6.26±0.23?? 6.98±0.19??大黃蒽醌苷低劑量組 7.81±0.11 6.71±0.21 6.33±0.34 7.28±0.17△大黃蒽醌苷中劑量組 7.56±0.26 6.46±0.17 6.38±0.27 7.38±0.17△大黃蒽醌苷高劑量組 7.09±0.20 6.14±0.07△△ 6.72±0.14△ 7.58±0.11△△7假手術(shù)組 6.28±0.44 4.82±0.13 7.28±0.24 7.99±0.23模型組 8.40±0.09?? 7.75±0.16?? 5.77±0.20?? 6.39±0.06??大黃蒽醌苷低劑量組 7.89±0.48△ 7.33±0.33△ 5.90±0.21 7.36±0.23△△大黃蒽醌苷中劑量組 7.15±0.30△△ 6.65±0.21△△ 6.50±0.25△△ 7.61±0.07△△大黃蒽醌苷高劑量組 6.35±0.30△△ 5.60±0.30△△ 6.83±0.21△△ 7.82±0.15△△

3.5 大黃蒽醌苷對腸道菌群的影響 表4顯示，給藥1 d后與假手術(shù)組比較，模型組大腸桿菌、腸球菌菌落數(shù)的對數(shù)值顯著升高（P＜0.01），乳酸桿菌、雙歧桿菌菌落數(shù)的對數(shù)值顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，大黃蒽醌苷低、中劑量組雙歧桿菌菌落數(shù)的對數(shù)值顯著升高（P＜0.05），高劑量組能顯著抑制腸球菌生成，促進雙歧桿菌、乳酸桿菌生成（P＜0.05，P＜0.01）。給藥 7 d 后與假手術(shù)組比較，模型組大腸桿菌、腸球菌菌落數(shù)的對數(shù)值顯著升高（P＜0.01），乳酸桿菌、雙歧桿菌菌落數(shù)的對數(shù)值顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，大黃蒽醌苷組（除低劑量組對乳酸桿菌無顯著影響外）顯著抑制大腸桿菌、腸球菌生成（P＜0.05，P＜0.01），促進乳酸桿菌、雙歧桿菌生成（P＜0.01）。

圖2顯示，假手術(shù)組中4種菌菌落數(shù)的對數(shù)值無明顯變化（P＞0.05）；模型組大腸桿菌、腸球菌菌落數(shù)的對數(shù)值顯著上升，乳酸桿菌和雙歧桿菌菌落數(shù)的對數(shù)值顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；大黃蒽醌苷組隨著劑量增加，大腸桿菌、腸球菌菌落數(shù)的對數(shù)值呈下降趨勢，乳酸桿菌和雙歧桿菌菌落數(shù)的對數(shù)值逐漸增加。

4 討論

近年來，“菌-腸-腦”軸概念的提出為研究腸道菌群與腦卒中預(yù)后提供新的思路和方法，腸道可通過內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、迷走神經(jīng)、一些胃腸激素和神經(jīng)遞質(zhì)等與大腦相互作用［14-15］，越來越多的研究表明，腸道菌群與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［16］。本實驗顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腸道內(nèi)大腸桿菌、腸球菌菌落數(shù)的對數(shù)值明顯增加，乳酸桿菌、雙歧桿菌菌落數(shù)的對數(shù)值顯著減少，而大黃蒽醌苷可顯著逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象，表明大鼠腦缺血再灌注損傷后腸道正常微生態(tài)平衡受到破壞，而大黃蒽醌苷可使腦缺血后腸道菌群失衡狀態(tài)得到一定改善。

缺血性腦卒中可引發(fā)腸道微生物紊亂，損害胃腸道菌群的功能；反之，腸道微生物改變也會通過炎癥反應(yīng)等來影響大腦損傷的預(yù)后［3］。國外報道顯示，腸道菌群可有效調(diào)節(jié)淋巴細胞數(shù)量，如調(diào)節(jié)性 T 細胞（Treg）和 γ δ T 細胞，其失調(diào)會對 Treg 細胞和白細胞介素（IL）17＋γδT 細胞產(chǎn)生影響，并且兩者均參與缺血性腦損傷［17］；Benakis等［5］在IS 小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，缺血性腦損傷急性期后Treg 細胞在缺血組織出現(xiàn)，并分泌大量抗炎細胞因子（IL-10），進而起到神經(jīng)保護作用；卒中發(fā)生后腸道菌群從胃腸道轉(zhuǎn)移到胃腸道以外的器官，應(yīng)激狀態(tài)也能促進菌群由消化道轉(zhuǎn)移至血液，從而誘發(fā)系統(tǒng)的免疫和炎癥反應(yīng)［18］，而免疫和炎癥反應(yīng)已被證實是腦缺血損傷發(fā)生機制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［17］。本實驗顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織IL-1β、TNF-α 水平明顯提高，而大黃蒽醌苷可有效降低，表明該成分能有效抑制炎癥反應(yīng)，進而改善腦缺血再灌注損傷。

正常的腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡時，將導(dǎo)致腸黏膜屏障受損，上皮細胞分泌產(chǎn)生更多的活性氧（ROS）［19］；SOD 為人體最重要的自由基清除劑，但過多的氧自由基將大量消耗該因子，從而降低其活性［20］，而大量 ROS 能攻擊生物膜中不飽和脂肪酸，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 大量產(chǎn)生，損傷組織 DNA［21］；NO 以L-精氨酸為底物，在一氧化氮合酶（NOS）催化下產(chǎn)生［22］。研究表明，腸道菌群的紊亂、移位可導(dǎo)致腸道內(nèi)毒素大量產(chǎn)生，內(nèi)毒素又可通過誘導(dǎo)NOS合成NO，后者過量時可誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡［23］。本實驗顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SOD 活性降低，MDA、NO 水平升高，而大黃蒽醌苷可逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象。

LD 是腸道菌群固有的產(chǎn)物，腸道菌群失調(diào)大量繁殖會導(dǎo)致其水平明顯升高，進而促進 LDH 活性提高［24］。本實驗顯示，腦缺血損傷提高大鼠腦組織LD 水平、LDH 活性，表明過多的LD 會損傷腦組織。

圖2 大黃蒽醌苷對腸道菌群的影響

蒽醌苷作為常見糖苷類物質(zhì)，由于其苷類結(jié)構(gòu)特點而在機體腸道中難以直接吸收利用，需要通過與腸道菌群的相互作用來發(fā)揮藥效［9］。本實驗推測大黃蒽醌苷可能通過調(diào)節(jié)腦缺血再灌注損傷大鼠腸道菌群，維護腸道微生態(tài)平衡，從而緩解炎癥反應(yīng)、氧自由基損傷等，并改善腦缺血性損傷。但目前還無法確認腸道菌群在大黃蒽醌苷治療大鼠腦缺血性損傷中是否起到主導(dǎo)作用，尚有待進一步研究。