HPLC-DAD-ELSD法同時測定22個產地通關藤中3種皂苷

李思雨，張冬月，韓 麗，張 慧

（遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600）

通關藤為蘿藦科牛奶菜屬植物通關藤Marsdenia tenacissima（Roxb.）Wight et Arn.的干燥藤莖，最早記載于 《滇南本草》，主產于云南、貴州、廣西等地，其味苦，性微寒，具有抗腫瘤、清熱解毒等作用，由通關藤為原料制成的消癌平制劑臨床應用廣泛［1-3］，用于治療胃癌、食管癌、肝癌等消化道腫瘤［4］，主要藥效物質是C21甾體皂苷類化合物［5］。目前，有關通關藤及其制劑的含有量測定方法大多以2015年版 《中國藥典》 收載的HPLC-ELSD 法測定通關藤H 為主，而且也有報道采用HPLC 法同時測定通關藤苷 G、I［6］，或通關藤苷 A、D 含有量［7］，UPLC-MS／MS 法測定通關藤苷 A、H、I 含有量［8］，HPLC-ELSD 法測定通關藤皂苷 L、M、N、O、P 含有量［9］，HPLC-UV 法測定通關藤苷 A 含有量［10］，比色法測定總皂苷含有量［11-14］等，但尚無HPLC-DAD-ELSD 聯用方法同時測定具有紫外吸收的通關藤苷G、I 及無紫外吸收的通關藤H 含有量。為了開發抗腫瘤新藥原料，并更好控制其提取物質量，本實驗建立HPLC-DAD-ELSD 法同時測定22 個產地通關藤中通關藤苷G、H、I 的含有量，為相關新藥開發奠定基礎，也為臨床用藥提供依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（配置真空脫氣機、四元泵及 DAD、ELSD 檢測器）；KQ-250DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JP60-4 型電子分析天平（沈陽市龍騰電子有限公司）；CP225D 型電子分析天平（十萬分之一，德國 Sartorius 公司）；RE-52A 型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥 通關藤苷H（批號111913-201202）對照品購自中國食品藥品檢定研究院；通關藤苷 G（批號PM0529SA13）、通關藤苷 I（批號 PM0529SB13）對照品均購自上海源葉生物科技有限公司。甲醇為色譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司）；乙腈為色譜純（天津星馬克科技發展有限公司）；水為純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.3 藥材 22 個產地通關藤均為實地采集，經遼寧中醫藥大學藥學院張慧教授鑒定為蘿藦科牛奶菜屬植物通關藤Marsdenia tenacissima（Roxb.）Wight et Arn.的干燥藤莖。藥材經70%乙醇提取后，濃縮干燥。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-水（45 ∶55）；體積流量1.0 mL／min；柱溫 30 ℃；檢測波長235 nm；進樣量20 μL。ELSD 參數為漂移管溫度80 ℃；載氣壓力3.5 bar（1 bar=100 kPa）；增益值 5。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取通關藤苷G、H、I 對照品適量，置于同一量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，即得（三者質量濃度分別為 0.841、1.921、1.513 mg／mL）。

2.2.2 供試品溶液制備 將提取物置于量瓶中，70%乙醇稀釋至 0.15 g／mL，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 取70%乙醇，按 “2.2.1”項下方法制備供試品溶液，即得。

2.3 專屬性試驗 精密吸取供試品、對照品、陰性對照溶液各20 μL，在 “2.1”項色譜條件下進樣測定，見圖1。可知，陰性對照溶液色譜圖中未見與對照品溶液中3種成分保留時間相同的色譜峰，表明陰性無干擾，方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC-DAD-ELSD 色譜圖

2.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液 0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL，置于 5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，在 “2.1”項色譜條件下進樣測定。其中，通關藤苷G、I（DAD）以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸；通關藤苷H（ELSD）以進樣量的自然對數為橫坐標（X），峰面積的自然對數為縱坐標（Y）進行回歸。結果，通關藤苷 G、H、I 方程分別為Y= 1 092X-317.76（r=0.999 2）、Y=1.139 5X＋4.471（r=0.999 0）、Y=472.89X-651.48（r=0.999 1），分別在 1.768～5.305、3.842～11.526、3.026～9.078 μg 范 圍 內呈良 好 的 線 性關系。

2.5 精密度試驗 精密量取對照品溶液20 μL，在 “2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得通關藤苷G、H、I 峰面積RSD 分別為0.94%、1.96%、1.01%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 精密稱取云南產藥材粉末6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下進樣測定，測得通關藤苷 G、H、I 含有量 RSD 分別為1.54%、1.90%、1.03%，表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 精密量取供試品溶液 20 μL，于 0、2、4、6、8 h 在 “2.1”項色譜條件下進樣測定，測得通關藤苷 G、H、I 峰面積 RSD 分別為 0.94%、1.91%、1.80%，表明供試品溶液在8 h 內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密加入通關藤苷G 對照品溶液（0.841 mg／mL）2.0 mL、通關藤苷H對照品溶液（0.102 4 mg／mL）3.0 mL、通關藤苷 I 對照品溶液（1.513 mg／mL）2.5 mL，置于同一量瓶中，平行 6 批，揮干溶劑，加入各成分含有量已知的提取物，按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表1。

2.9 樣品含有量測定 分別取22 個產地提取物，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表2。

表2 各成分含有量測定結果

3 討論

3.1 指標成分選擇 2015年版 《中國藥典》 一部中，通關藤含有量測定成分僅選擇通關藤苷H，難以準確反映其藥效。課題組前期藥效學實驗發現，通關藤苷 G、H、I 具有明顯抗腫瘤作用，故本實驗選擇三者作為指標成分。

3.2 色譜條件選擇 本實驗曾采用 40 ∶60、47 ∶53、50 ∶50等比例的乙腈-水流動相，發現在45 ∶55 時通關藤苷G、H、I 分離效果最好，峰形最佳。由于通關藤苷 G、I 有紫外吸收，而通關藤苷 H 無紫外吸收，故本實驗采用HPLC-DAD-ELSD 法，并且發現該方法靈敏度高，重復性好。

3.3 含有量分析 除廣西、四川2 個批次外，其他20 個產地通關藤70% 乙醇提取物中通關藤苷H 含有量均符合2015年版 《中國藥典》 不得低于0.12%的規定；不同產地提取物中通關藤苷G、H、I 含有量差異明顯，其中通關藤苷H 可達33 倍，并且通關藤苷I 普遍高于其他2種成分，表明多成分同時測定可更全面科學地評價該藥材質量。