基于UPLC-Q-TOF／MS法分析不同產地前胡藥材質量

李穎碩，周 秀，李瑞芳，徐增萊，蓋亞男?

（1.江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇 南京 210014；2.深圳市和順本草藥業有限公司，廣州 深圳 518027）

前胡為傘形科植物白花前胡Peucedanum PraeruptorumDunn 的干燥根，始載于 《名醫別錄》，被列為中品，性微寒，味苦、辛。具有宣散風熱、降氣化痰的功效。臨床主要用于風熱頭痛、痰多咳喘、上呼吸道感染等癥［1-2］。前胡產地眾多，浙江、安徽、江西、湖北、貴州、湖南、重慶等地為道地產區。近年來，在安徽、四川等地也有大范圍種植。香豆素類是前胡質量評價的重要指標，以角型吡喃香豆素、呋喃香豆素為主［3-4］。

前胡質量受到產地、氣候、采收時間等因素影響，2015版 《中國藥典》 以白花前胡甲素、白花前胡乙素為含有量測定指項標。現有前胡指紋圖譜研究使用 HPLC 法建立6 個共有峰［5］，缺少對其化學成分的綜合評價及多指標含有量測定的研究方法。近年來由于超高效液相色譜-飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF／MS）具有高分離能力和高分辨質譜的鑒定能力，而廣泛用于中藥成分分析與鑒定［6-7］。本實驗收集傳統藥材產區和新興藥材產區的前胡藥材，進行指紋圖譜研究和多共有成分含有量測定，為前胡的質量評價提供更全面、科學的依據。

1 儀器與材料

島津LC-2010AHT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；TP040S 超聲波清洗設備（深圳潔夢清洗設備有限公司）；AB204 電子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；Agilent 1260 UPLC-6530Q-TOF／MS儀，配置電噴霧離子源、MassHunter 5.0 工作站、PCDL B.03.01 數據庫（美國 Agilent 公司）。甲醇（美國Tedia 公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。白花前胡甲素（ps0422-0020-ps000114，含有量≥98.5%）、白花前胡乙素（ps0422-0020-ps000116，含有量 ≥ 98.5%）、白花前胡E素（ps0423-0020-ps001175，含有量≥98.5%）對照品購于成都普思生物有限公司。

前胡藥材均為 1年生，2017年采集，由廣州深圳市和順堂醫藥有限公司等提供，23 批藥材經江蘇省中科院植物研究所徐增萊研究員鑒定為正品。信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 UPLC-Q-TOF／MS 定性 分析 ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～15 min，40%A；15～16 min，40%～60% A；16～36 min，60%A；36～56 min，60%～100% A；56～60 min，100%A）；柱溫 30 ℃；體積流量 1 mL／min；檢測波長270 nm。電噴霧離子源（ESI），正離子模式；掃描范圍m／z100～1 500；毛細管電壓3 500 V；碎裂電壓 170 V；干燥氣（N2）體積流量 10 L／min；干燥氣溫度350 ℃；霧化氣壓力344.75 kPa；碰撞誘導解離（CID）能量 35 eV；碰撞氣 N2。實驗數據采用 Masshunter Qualitative Analysis（B.05.00）分析軟件和 PCDL Manager（B.03.0l）處理。

2.1.2 HPLC-DAD 定量分析 0～10 min，10%～20%A；10～36 min，20%～70% A；36～46 min，75%A；柱溫 30 ℃；體積流量 1 mL／min；檢測波長320 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 分別精密稱取白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡 E 素 0.525、0.250、0.350 mg，置于 1 mL 量瓶，用 100% 甲醇溶解，定容，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 白花前胡干燥根打粉，取粉末（過3 號篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入100%甲醇10 mL，超聲（功率 250 W，頻率40 kHz）處理10 min，補足減失質量，過 0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 精密吸取同一供試品（S1）溶液，在 “2.1”項條件下分別在相同的儀器上重現6 次，各主要色譜峰相對保留時間的RSD 均小于0.3%，相對峰面積的RSD 均小于2.0%，表明該儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取同一供試品（S1）溶液，在 “2.1”項色譜條件下，于制備后 0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，各主要色譜峰相對保留時間的RSD 均小于1.0%，相對峰面積的RSD 均小于2.0%，表明該方法穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批藥材（S1）6 份，按 “2.3”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”條件下平行進樣6 次，各主要色譜峰相對保留時間的RSD 均小于1.0%，相對峰面積的RSD 均小于2.0%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 線性關系考察 將混合對照品溶液按照2倍稀釋法，共稀釋4 次，得到不同質量濃度的混合對照品溶液，在 “2.1.2”項條件下，以對照品溶液的質量濃度為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表2。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取已測定含有量的同一批藥材（S1）6 份，每份 0.5 g，分別加入相當于0.5 g 藥材含有量的對照品，按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下進樣，計算回收率。測得白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡 E 素的平均回收率分別為101.2%、99.7%、96.8%，RSD 分 別 為 1.3%、1.4%、1.7%。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4 指紋圖譜建立

2.4.1 色譜峰歸屬 白花前胡 23 批藥材按“2.3”項下方法制備試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下進樣，記錄UPLC 圖，用 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004A版）進行分析，得到白花前胡的UPLC 對照指紋圖譜見圖1，其中共有峰23 個。

圖1 白花前胡對照指紋圖譜Fig.1 HPLC reference spectrum of P.Praeruptorum

2.4.2 相似度分析 按照2015版 《中國藥典》中前胡含有量測定的方法對S1 樣品進行測量，結果顯示白花前胡甲素、白花前胡乙素含有量均高于藥典規定的最低數值，故以S1 為參照圖譜，統計23 批樣品圖譜的相似度，見圖2。23 批藥材圖譜與參照圖譜的平均相似度依次為0.958、0.958、0.970、0.986、0.960、0.987、0.959、0.991、0.965、0.963、0.946、0.960、0.139、0.911、0.963、0.911、0.972、0.953、0.977、0.966、0.956、0.958，結果相似度大多都在 0.9，且只有1 個低于0.9，表明23 批藥材相似度良好。

圖2 23 批白花前胡HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of twenty-three batches of P.Praeruptorum

2.4.3 前胡共有峰鑒定 在 “2.1”項條件下進樣檢測，通過各化合物的準分子離子峰確定其分子式，進一步通過質譜碎片，結合文獻報道［8-16］和對照品對前胡成分進行結構推測和驗證，從前胡共有峰中鑒定出20 個化合物，結果見圖3、表3。

圖3 前胡飲片基峰圖Fig.3 Base peak ion chromatogram of P.Praeruptorum decoction pieces

2.5 比較不同產地前胡質量統計23 批白花前胡藥材的指紋圖譜共有峰的峰面積，見圖4。將23 批藥材 按 “2.3”項下方法制備試品溶液，在“2.1.2”項色譜條件下進樣，結果見表4。顯示不同產地的白花前胡中的白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素含有量有明顯差異。

圖4 23 批樣品共有峰峰面積三維條形圖Fig.4 3-D bar chart of the peak area of common peaks of twenty-three batches of samples

表3 前胡化學成分鑒定Tab.3 Identification of chemical constituents from P.Praeruptorum

對不同產地的前胡藥材進行收集和含有量測定，23 批樣品所含的白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡 E 素含有量的 RSD 值分別為47.527%、134.056%、46.814%，表明不同產地的白花前胡藥材所含3種香豆素類化合物的含有量存在顯著差異。除S15 樣品的前胡外，其他地區的藥材白花前胡甲素大于白花前胡乙素的含有量。

圖4、表4顯示，11月份采收品 S16、S17、S19、S21 白花前胡乙素含有量低于白花前胡E 素，S18、S20 中相反；12月份采收品 S2-S9、S13-S16、S22 中白花前胡乙素含有量小于白花前胡E 素的含有量。

產地為湖北的前胡藥材（S10-S12）的3種香豆素類化合物的含有量相差不大，但其3種香豆素類化合物的含有量偏少，而產地為貴州的前胡藥材（S7-S9）的3種香豆素類化合物的含有量相差不大且其含有量均高于湖北的前胡藥材（S10-S12）。

3 討論

3.1 提取條件考察 研究中分別采用甲醇、三氯甲烷、乙醇、50%乙醇、水超聲提取，采用甲醇溶液溶解，并采用超聲儀超聲10 min，色譜峰量多，峰面積大，且該方法提取方便，操作簡單，重復性好。

3.2 波長選擇 本實驗比較 220、270、322、350 nm處的色譜圖，結果表明270 nm 處前胡藥材色譜峰信息最全，特征性最強，故選擇270 nm 波長為指紋圖譜檢測波長。在320 nm 處3種待測香豆素成分的紫外吸收度最強，故選擇320 nm 波長進行含有量測定。

3.3 結果分析 本實驗采用甲醇超聲提取，反相色譜柱分離，主要針對中等及大極性成分進行定性、定量分析，對前胡藥材的質量研究也偏向于極性化合物，后續研究將建立對前胡脂溶性成分的分析方法，更全面地對前胡藥材質量進行研究。同時，本實驗對前胡藥材3種香豆類成分的含有量測定發現，貴州產的前胡藥材質量穩定且3種香豆素類化合物的含有量高。另外，指紋圖譜相似度顯示，除S14 藥材外其他前胡藥材相似度達到0.9 以上，且在疊加指紋圖譜中發現S14 藥材的指紋圖譜與其他藥材的存在明顯差異，可能與種植地的栽培方法、土壤環境、地勢等有關系，后續將對四川涼山地區不同環境下生產前胡的化學成分進行進一步研究。同時對23 個共有峰進行進行結構推測，而針對其中3種共有成分白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素的含有量測定結果顯示，不同產地藥材存在顯著差異。為進一步全面反映藥材質量，后續研究還應增加共有成分的定量指標，為全面評價中藥質量提供了可行的方法。

表4 各成分含有量測定結果（%）Tab.4 Results of content determination of various constituents（%）

致謝感謝藥材提供單位深圳市和順本草藥業有限公司、浙江省藥檢院、江蘇華宏藥業有限公司、南京食品藥品監督院、徐州食品藥品監督中心、南京中醫藥大學附屬醫院。