HPLC法同時測定不同產地龍膽酒炙前后3種環烯醚萜苷

呂 新，孫建之，徐士釗，才 謙?，曹麗娟，姜恒麗

（1.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600；2.盛實百草藥業有限公司，天津 300301）

龍膽為龍膽科植物條葉龍膽Gentiana manshuricaKitag.、龍膽Gentiana scabraBge.、三花龍膽Gentiana trifloraPall.或堅龍膽Gentiana rigescensFranch.的干燥根及根莖。前3種習稱龍膽，后 1種習稱堅龍膽［1］。龍膽的生長范圍廣泛，遍布于黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、浙江、江蘇、廣東、云南、新疆等地。其主要成分為環烯醚萜苷類，以含有量較高的龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐芽菜苷為代表［2-7］。歷史上記載龍膽的炮制方法有很多，如酒龍膽、龍膽炭、膽汁制龍膽、蜜龍膽、姜龍膽等［8-10］，目前廣泛應用的是生龍膽和酒龍膽。藥材經過酒制后，發生了物理和化學變化，會導致藥性緩和或改變［11-13］。傳統理論認為酒炙以熱制寒，可緩和生龍膽苦寒之性及引藥上行［14］。采用HPLC 法對22 個不同產地的生龍膽和對應的自制酒龍膽中3種成分進行含有量測定，并比較酒炙前后含有量差異。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀Angilent1100、SPD-l0A 紫外檢測器（美國安捷倫公司）；GTSONICP13 型超聲波清洗器（江蘇蘇州江東精密儀器有限公司）；CP225D 型電子天平（十萬分之一，北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

1.2 材料 龍膽飲片收集于不同產地，見表1，由遼寧中醫藥大學鑒定教研室李峰教授進行鑒定為正品；酒龍膽為自制（方法參考2015年版 《中國藥典》Ⅰ附錄ⅡD 酒炙法）。黃酒（浙江塔牌紹興酒有限公司，產品標準號GB／T17946）。龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐芽菜苷對照品均購自江蘇永健醫藥科技有限公司，含有量均≥98%；甲醇（色譜級，天津市大茂化學試劑廠）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2 方法與結果

2.1 吸收波長確定 將藥材提取液進行紫外全波長掃描，龍膽苦苷在270 nm 處有明顯吸收峰，而獐牙菜苦苷和獐芽菜苷較差；在240 nm 處3種成分都有明顯吸收，故檢測波長為240 nm。

2.2 色譜條件 Welchrom C18柱（4.6 nm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～25 min，8%～45%A；25～35 min，45%～48%A；35～45 min，48%～65%A；45～50 min，65%～90%A）；檢測波長240 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫 25 ℃；進樣量 20 μL。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取適量的龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐芽菜苷對照品，放置在10 mL量瓶中并加甲醇至刻度處，制得3種成分混合對照品溶液。質量濃度分別為 2、0.2、16 μg／mL。

2.4 供試品溶液制備 將22 批不同產地的生、酒龍膽粉末過60 目篩，分別取0.5 g，精密稱定，加入甲醇 20 mL，記錄質量，放入超聲儀器中，30 min后放冷再稱定質量，用甲醇補足減失質量，過濾定容至 25 mL 量瓶中，濾液經 0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得，避光，置于冰箱中4 ℃備用。

2.5 方法學考察

2.5.1 系統適用性試驗 取遼寧清原生、酒龍膽制備的供試品溶液和混合對照品溶液，在 “2.2”項色譜條件下進樣測定，見圖1。龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐芽菜苷的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均符合要求，與其他組分完全分離。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.2 線性關系考察 取龍膽苦苷標準品20.00 mg，且精密稱定于10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度線處制成2.0 mg／mL 對照品貯備液。精密吸取龍膽苦苷對照品貯備液加甲醇制成質量濃度分別為 0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg／mL的溶液，搖勻。質量濃度從低到高分別精密吸取20 μL，在 “2.2”項色譜條件下進樣，以化合物進樣量為橫坐標（X），色譜峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸，得回歸方程為Y=930.39X-127.68（r= 0.999 5），表明龍膽苦苷在 1.25～40 μg范圍內線性關系良好。

另稱取獐牙菜苦苷標準品12.5 mg，且精密稱定于 25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度線處制成500 μg／mL的對照品貯備液。分別精密吸取獐牙菜苦苷對照品貯備液加甲醇制成質量濃度分別為12.5、25、50、100、150、200 μg／mL 的溶液，搖勻。質量濃度從低到高分別精密吸取 20 μL，在“2.2”項色譜條件下進樣，以化合物進樣量為橫坐標（X），色譜峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸，得回歸方程為Y= 1 391.1X-121.48（r=0.999 2），表明獐牙菜苦苷在0.25～4 μg 范圍內線性關系良好。

另稱取獐芽菜苷標準品1.60 mg，且精密稱定于100 mL 量瓶中，加甲醇至刻度線處制成16 μg／mL的對照品貯備液。精密吸取獐芽菜苷對照品貯備液加甲醇制成質量濃度分別為0.5、1、2、4、8、16 μg／mL 的溶液，搖勻。質量濃度從低到高分別精密吸取20 μL，在 “2.2”項色譜條件下進樣，以化合物進樣量為橫坐標（X），色譜峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸，得回歸方程為Y=1.903 5X-1.322 4（r=0.999 8），表明獐芽菜苷在10～320 ng 范圍內線性關系良好。

2.5.3 精密度試驗 取遼寧清原生龍膽粉末，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2”項色譜條件下連續進樣5 次且每次20 μL，龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐芽菜苷峰面積積分值的RSD 分別為 0.81%、0.52%、0.77%，表明該儀器精密度良好。

2.5.4 穩定性試驗 取遼寧清原生龍膽粉末，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2”項色譜條件下，分別于 0、4、8、12、24、48 h 進樣分析并計算其3種成分含有量。結果龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐芽菜苷的RSD 分別為1.07%、0.68%、1.27%，表明供試品溶液在48 h 內穩定性良好。

2.5.5 重復性試驗 取遼寧清原生龍膽粉末5 份，按 “2.4”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2”項色譜條件下進樣并計算5 份供試品中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐芽菜苷含有量。測得平均值分別為23.58、1.86、0.49 mg／g，RSD 分 別 為 0.66% 、0.92%、0.84%，表明該方法重復性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 取已知含有量的龍膽樣品粉末 0.5 g，精密稱定，共 9 份，每 3 份加入高、中、低3 個質量濃度梯度對照品溶液，其加入對照品量與供試品中量的比例分別為1.5 ∶1、1 ∶1、0.5 ∶1，按 “2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下分別進樣并計算。得龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐芽菜苷平均加樣回收率分別為100.26%、99.84%、100.17%，RSD 分 別 為1.32% 、1.59% 、1.16% 。

2.6 樣品含有量測定 將不同產地生品和炮制品龍膽樣品溶液，在 “2.2”項色譜條件下測定，并計算，結果見表1。

3 討論

本實驗建立HPLC 法同時測定龍膽飲片中3種成分的含有量，分別考察了乙腈-水和甲醇-水2種流動相體系。結果表明乙腈-水溶液作流動相時，3種成分不能很好分離，存在較大雜峰干擾獐芽菜苷，而甲醇-水溶液分離較好，也無雜峰干擾。

實驗中收集了22 個產地的商品生龍膽飲片，因品種和產地有所不同，可能在各樣品之間化學成分的種類和含有量有一些差異，故本實驗選擇了龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐芽菜苷作為指標性成分進行含有量測定并比較［15-18］。結果表明，不同產地樣品中3種成分的含有量存在明顯差別，遼寧新賓的龍膽苦苷含有量高達65.875 mg／g，而西藏拉薩此成分含有量最低，為4.217 mg／g；遼寧新賓的獐牙菜苦苷含有量也高于其他產地，為3.170 mg／g，而寧夏銀川在該成分的含有量則為0.285 mg／g；遼寧清原的獐芽菜苷最高，為 0.484 mg／g，西藏拉薩該成分的含有量最低，為0.069 mg／g。

通過HPLC 法測定不同產地的商品生龍膽和相應酒炙飲片中3種成分的含有量，結果表明，大多數產地龍膽酒炙后龍膽苦苷含有量增加，但酒炙后獐牙菜苦苷和獐芽菜苷含有量變化不一致，一些產地的飲片經過黃酒炮制后含有量上升，還有一些產地含有量下降。推測龍膽酒炙后龍膽苦苷含有量增加的原因可能是經炮制后發生了一系列的化學變化，使該成分含有量增加，也可能是酒炙促進了其溶解；而龍膽酒炙后其他2種成分含有量變化不一的原因尚無法做出科學解釋。這3種成分酒炙后含有量發生改變的原因都有待深入研究。

表1 各成分含有量測定結果（mg／g， n=3）Tab.1 Results of content determination of various constituents（mg／g， n=3）