正品、偽品治糜康栓的差異特征元素分析及無機元素特征譜

劉圣金，喬婷婷，馬瑜璐，房 方，林瑞超，孫云飛，吳德康?

（1.南京中醫藥大學江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心，江蘇省中藥功效物質重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.北京中醫藥大學，北京 100029；3.江蘇省中醫院，江蘇 南京 210029）

治糜康栓，曾用名治糜靈栓，為通化金馬藥業集團股份有限公司生產的中藥復方栓劑，現收載于2015年版 《中國藥典》（一部）［1］。由黃柏、苦參、兒茶、枯礬和冰片5 味中藥加工制成的陰道栓，具有清熱解毒、燥濕收斂的功效。礦物藥枯礬為白礬的炮制品，是治糜康栓的生產原料之一。本課題組前期研究表明［2-3］，目前市場流通的白礬藥材有2種，1種為鉀明礬即成分主含含水硫酸鋁鉀［KAl（SO4）2·12H2O］，由硫酸鹽類礦物明礬石加工提煉制成；另1種為銨明礬即成分主含含水硫酸鋁銨［NH4Al（SO4）2·12H2O］，由化學合成制得，多用于化工，不作為藥用。鉀明礬為現行版《中國藥典》 收載品種，為白礬的正品，銨明礬為枯礬常見的偽品。對市場收集的32 批白礬藥材鑒定顯示，僅有8 批為鉀明礬，合格率25.0%；檢測近40 批枯礬樣品測定，合格率僅為10.5%。目前國內市場流通白礬藥材多為化學合成，僅少數白礬藥材是通過礬礦的采礦、選礦、熟化、溶解、純化、結晶等工藝制得，這種現狀給臨床用藥的安全性、有效性帶來了隱患。

本實驗通過自制10 批正品治糜康栓（方中枯礬為鉀明礬制備）和6 批偽品治糜康栓（方中枯礬為銨明礬制備），以微波消解-ICP-OES／MS 技術測定樣品中各無機元素的含有量，研究正品和偽品治糜康栓的差異特征元素及其無機元素特征譜，為其質量控制提供參考。

1 材料

Perkin Elmer 350 D 電感耦合等離子體-質譜儀、Perkin Elmer Optima 8000 電感耦合等離子體-原子發射光譜儀（美國 Perkin Elmer 公司）；Mettler Toledo ME104E 電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；工業高純氬氣（南京天澤氣體有限責任公司）。

Al、K、Fe、Hg、Au 單元素標準溶液，含 As、Ba、Be、Cd、Cr、Cu、Ga、Mn、Ni、Pb、Sb、Sn、Tl、Zn 的多元素標準溶液（100 μg／mL），Ge、In、Tb 的多元素標準溶液（10 μg／mL）（國家有色金屬及電子材料分析測試中心）；調諧液為Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb、U 的混合標準溶液（1 μg／L，美國 PE 公司）。65% 硝酸（優級純，德國Merck 公司）；超純水。10 批正品治糜康栓樣品和6 批偽品治糜康栓樣品，見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 測定條件［3-6］

2.1.1 ICP-OES 工作參數 RF 功率 1 300 W；霧化氣體積流量 0.55 L／min；輔助氣體積流量0.2 L／min；冷卻氣體積流量 12 L／min；樣品提升量1.5 mL／min；延遲時間 30 s；重復次數 1；測量方式為標準曲線法。待測元素分析線（nm）分別為 Al 396.153、K 766.490、Fe 238.204。

2.1.2 ICP-MS 工作參數 RF 功率 1 100 W；霧化氣體積流量 0.92 L／min；輔助氣體積流量1.2 L／min；冷卻氣體積流量 15 L／min；碰撞氣（氦氣）體積流量 3 mL／min；采樣錐孔徑1.1 mm；截取錐孔徑0.9 mm；超級截取錐孔徑1.0 mm；積分時間1 s；延遲時間40 s；掃描方式為單點跳峰；重復次數3。見表2。

表2 ICP-MS 待測元素質量數、檢測模式與內標元素Tab.2 Mass，detection mode and internal standards of ICP-MS determined elements

2.2 標準溶液制備［3，7-9］

2.2.1 Al、K、Fe、Hg 對照品溶液制備 精密量取 Al、K、Fe、Hg 單元素標準液適量，用 3%HNO3溶液稀釋制成每1 mL 對照品溶液含Al，K元素量均為 0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100、200 μg，含 Fe 元素 0.05、0.1、0.5、1、5、10 μg，含 Hg 元 素 0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 ng。

2.2.2 含多元素對照品溶液制備 精密量取多元素標準品貯備液適量，用3%HNO3溶液稀釋制成每 1 mL 含 As、Ba、Be 3種元素 0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100 ng 的系列質量濃度混合溶液。

2.3 內標溶液制備 精密量取Ge、In、Tb 多元素標準液適量，用3%HNO3溶液配制制成每1 mL 含Ge、In、Tb 10 ng 的混合內標溶液。

2.4 供試品溶液制備 將各治糜康栓樣品剪碎，樣品取碎塊約0.2 g，精密稱定，精確加入HNO36 mL，于通風廚中靜置 30 min，后于電熱板上80 ℃進行預消解，待反應40 min 后，再精確加入H2O22 mL，繼續反應至無明顯泡沫后，加蓋密封，裝入微波消解儀中，按預設程序進行消解，程序見表3。消解完成后，待溫度降至70 ℃以下，取出消解罐，置于電熱板上100 ℃加熱揮酸，然后將消解液轉移至50 mL 量瓶中，加入200 μL Au 單元素標準溶液（1 μg／mL），用超純水定容至刻度，搖勻，即為各供試品溶液。除不加Au 單元素標準溶液外，同法制備試劑空白溶液。所得到的樣品消解液無色、澄清透明、無固體殘渣，表明樣品被完全消解。

表3 微波消解程序Tab.3 Digestion programs

2.5 方法學考察［10-14］

2.5.1 線性關系考察 通過預實驗，制備對照品溶液。根據待測元素ICP-MS、ICP-OES 測定方法，上機檢測18種無機元素不同質量濃度的對照品溶液，ICP-MS 以對照品分析峰響應值與內標元素參比峰響應值的比值為縱坐標（I），ICP-OES 測定縱坐標為對照品分析峰響應值，對照品質量濃度為橫坐標（C），進行回歸，結果見表4。

2.5.2 檢測限 重復測定空白樣品溶液10 次，根據IUPAC 規則以3 倍標準偏差所對應的質量濃度作為各元素的方法檢出限。由實驗結果可知檢測限范圍為 0.001～2.380 μg／L，能滿足待測無機元素分析需求，結果見表4。

2.5.3 精密度試驗 取治糜康栓供試品溶液，連續測定6 次，計算各待測元素 RSD 在 0.05～4.34之間，表明該方法精密度良好。

2.5.4 重復性試驗 取治糜康栓小塊約0.2 g，精密稱定，平行6 份，進行測定，計算各待測元素 RSD 在 0.93～6.33 之間，表明該方法精密度良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 取已知元素含有量的治糜康栓樣品約0.2 g，精密稱定，平行 9 份，分別加入各元素標準溶液適量。按 “2.4”項下方法制備供試品溶液，同法測定，計算各待測元素加樣回收率范圍均在80%～120%，結果見表5。

表4 各元素線性關系和檢測限Tab.4 Linear relationships and detection limits of various elements

表5 各元素加樣回收率試驗結果（n=9）Tab.5 Results of recovery tests for various elements（n=9）

2.6 樣品含有量測定 在上述方法學考察基礎上，取供試品溶液依次測定，結果見表6。顯示，常量元素正品治糜康栓中K 含有量最高，均值為2.41×104mg／kg，Al、Fe 次之，均值分別為 1.37×104、6.37×10 mg／kg；偽品治糜康栓中 Al 含有量最高，均值為 1.49×104mg／kg，K、Fe 次之，均值分別為3.86×103mg／kg、4.32×102mg／kg。微量元素正品治糜康栓中Mn、Zn、Cr 含有量最高，均值分別為9.738、5.980、1.229 mg／kg，其他微量元素含有量均低于 1.000 mg／kg；偽品治糜康栓中 Mn、Zn、Ga、Cr 的含有量最高，均值分別為 15.477、5.965、2.000、1.432 mg／kg，其他微量元素含有量均低于1.000 mg／kg。2 類樣品中重金屬及有害元素含有量由高到低均依次為 Cu、As、Pb、Cd、Hg，正品治糜康栓中均值分別為2.497、0.142、0.079、0.002、0.001 mg／kg，偽品治糜康栓中均值分別為2.318、0.250、0.121、0.002、0.001 mg／kg，大部分樣品未檢出Hg。

2.7 聚類分析 采用SPSS 16.0 統計軟件組間平均鏈鎖法進行分層聚類分析，Z score 法進行標準化處理，測度選用歐氏距離平方，結果見圖1。表明，16 批治糜康栓樣品聚為兩大類，ZP1～ZP10（正品治糜康栓組）聚為一類，WP1～WP6（偽品治糜康栓組）聚為一類，表明兩類治糜康栓樣品中無機元素的含有量特征存在明顯的差異。

圖1 16 批樣品聚類樹狀圖Fig.1 Dendrogram of sixteen batches of samples

2.8 差異性無機元素識別［3-10］圖2 表明，利用SIMCA-P 13.0 分析軟件對16 個正品和偽品治糜康栓樣品進行主成分分析，獲得樣品的主成分分析得分圖，可知，16 批樣品分為明顯的 2 個區域，與聚類分析結果相同，其中正品治糜康栓分布在-2.93＜PC1＜-1.86，-1.07＜PC2＜2.20 的區域，偽品治糜康栓分布在 3.17＜PC1＜4.72，-4.04＜PC2＜2.52 的區域。各元素分布載荷圖見圖3，提示離中心較近的分布是正品治糜康栓和偽品治糜康栓兩類樣品中含有量相差較小的元素，離中心較遠分布的為含有量相差較大的元素。通過t檢驗、秩和檢驗比較樣品中差異性無機元素，共篩選出12種元素含有量具有顯著性差異（P＜0.05），分別為 Be、Al、K、Mn、Fe、Ni、Ga、As、Sn、Ba、Tl、Pb。

表6 各無機元素含有量測定結果（mg／kg）Tab.6 Results of content determination of various inorganic elements（mg／kg）

圖2 16 批樣品主成分分析圖Fig.2 PCA plot for sixteen batches of samples

2.9 無機元素特征譜建立［3-10］根據不同元素測定結果，篩選16種共有元素，取各元素含有量的平均值，建立正品治糜康栓和偽品治糜康栓的無機元素特征圖譜。以便于繪圖，縱坐標以對數Log10的形式表示。以方便比較，將正品、偽品治糜康栓的無機元素特征圖譜集中繪制，見圖4?？芍?，兩類樣品的無機元素特征圖譜的走勢存在差異，如K、Ga 處走勢具明顯差異，因此可以利用該特征圖譜鑒別正品、偽品治糜康栓。

圖3 16 批樣品主成分分析載荷圖Fig.3 Loadings scatter plot of principal component analysis of sixteen batches of samples

3 討論

正品治糜康栓中 Cu、As、Cd、Hg、Pb 的平均含有量分別為 2.497、0.142、0.002、0.001、0.079 mg／kg，偽品治糜康栓中平均含有量分別為2.318、0.250、0.002、0.001、0.121 mg／kg。在2015年版《中國藥典》（一部）收載的39種含礦物藥外用制劑中，僅婦必舒陰道泡騰片有明確的Cu、As、Cd、Hg、Pb 限量規定，即 Cu ≤20 mg／kg、As≤2 mg／kg、Cd≤0.3 mg／kg、Hg≤0.2 mg／kg、Pb≤5 mg／kg。2007年版 《化妝品衛生規范》［15］中對 Hg、Pb、As 的限量值分別為 Hg≤1 mg／kg（含有機汞防腐劑的眼部化妝品除外）、Pb≤40 mg／kg、As≤10 mg／kg。參照上述標準，正品治糜康栓和偽品治糜康栓中重金屬及有害元素的含有量均未超出限量要求。

圖4 16 批樣品無機元素特征圖譜Fig.4 Characteristic spectrum of inorganic elements of sixteen batches of samples

通過微波消解ICP-OES／MS 技術對正品、偽品治糜康栓中18種無機元素進行含有量測定，正品治糜康栓中K 含有量最高，偽品治糜康栓Al 含有量最高。對16 批樣品進行聚類分析，分為正品治糜康栓和偽品治糜康栓兩類，并從中篩選得到12種含有量具有顯著性差異（P＜0.05）的元素。正品、偽品治糜康栓差異性特征元素及無機元素特征譜，可作為治糜康栓質量控制手段之一。此外，正品、偽品治糜康栓中無機元素含有量及分布規律的差異性是否會對糜康栓的安全性與有效性產生影響，有待進一步深入研究。