UPLC-MS／MS法同時測定辛夷中12種木脂素

楊雁蕓，張艷麗，何玉環，白志堯，鄭曉珂，馮衛生

（1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；2.呼吸疾病診療與新藥研發河南省協同創新中心 河南 鄭州 450046）

辛夷又名木筆花、毛辛夷，是木蘭科落葉喬木植 物 玉 蘭Magnolia denudataDesr.、望 春 花Magnolia biondiiPamp.或武當玉蘭Magnolia sprengeriPamp.的干燥花蕾［1］，主產于河南、四川、湖北、浙江及安徽等地［2-3］。其性溫味辛，具有散風寒、通鼻竅之功效，可用于治療鼻塞、鼻炎、風寒頭痛等［4-6］。辛夷中含有木脂素、黃酮、萜類及生物堿等多種化學成分，木脂素是其主要的一類活性成分［2，7-8］。研究顯示，木脂素類化合物具有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、血小板活化因子拮抗活性等多種藥理作用［9-11］。

2015版 《中國藥典》 對辛夷的質量控制標準為含木蘭脂素不得少于 0.40%［1］，單一的化學成分難以全面保障和反映藥材的品質及其有效性。因此，本實驗采用UPLC-MS／MS 法同時測定辛夷中12種木脂素類成分的含有量，以期為提升辛夷及其制劑的質控標準提供參考和依據。

1 儀器與材料

ACQUITY 超高效液相色譜儀，配TQD 三重四級桿質量分析器和Masslynx4.1 色譜工作站（美國Waters 公司）；AB135-S 型電子分析天平（十萬分之一，瑞士 Mettler Toledo 公司）；XK80-A 型快速混勻器（江蘇新康醫療器械有限公司）；CENRIFUGE 5810R 離心機（德國 Eppendorf 公司）；SB-5200DTD 型超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

對照品桉脂素（含有量98.36%）、木蘭脂素（含有量94.52%）、epimagnolin（含有量95.83%）、里立脂素B 二甲醚（含有量96.54%）、落葉松樹脂醇-4′-O-β-D-葡萄糖苷（含有量90.83% ）、7R?，8S?-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol-4-O-β-D-glucopyranoside（DAG，含 有 量99.43% ）、4，4′-dimethoxy-3′-hydroxy-7，9′：7′，9-diepoxylignan-3-O-β-D-glucopyranoside（DHDG，含有量 90.72% ）、3′，4-O-dimethylcedrusin（含有量 98.88%）、松脂醇（含有量 90.99%）、fargesol（含有量95.26%）、辛夷脂素（含有量97.91%）、conicaoside（含有量92.87%），均由本實驗室前期分離制備所得，1H，13C-NMR 和MS 數據均與文獻報道［12-20］一致，含有量經高效液相色譜（面積歸一化法）檢測所得。甲醇、甲酸（均為色譜級，美國Fisher 公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。4 批辛夷藥材購于鄭州各大藥店，批號分別為 20140609、170501、170201、161206，經河南中醫藥大學董誠明教授鑒定均為望春花Magnolia biondiiPamp.的干燥花蕾。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取適量的各對照品，分別置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解后定容至刻度，搖勻即得各木脂素類成分的單一對照品貯備液。精密量取上述對照品溶液，加60% 甲醇水溶液，稀釋配制成含桉脂素 3 600 μg／mL、木蘭脂素1 030 μg／mL、epimagnolin 2 160 μg／mL、里立脂素B 二甲醚 1 940 μg／mL、落葉松樹脂醇-4′-O-β-D-葡萄糖 苷 62.7 μg／mL、DAG 8.3 μg／mL、DHDG 20.6 μg／mL、3′，4-O-dimethylcedrusin 170 μg／mL、松脂醇 79.4 μg／mL、fargesol 570 μg／mL、辛夷脂素 530 μg／mL、conicaoside 14 μg／mL 的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取辛夷藥材，分別打粉并過3 號篩后得藥材粉末。精密稱取0.5 g 藥材粉末，置入100 mL 具塞錐形瓶中，加入60%甲醇水溶液50 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率200 W，頻率 40 kHz）提取 1 h，冷卻至室溫，再次稱定質量后用60% 甲醇水溶液補足減失的質量，搖勻，12 000 r／min 離心 10 min，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取濾液即得。

2.2 色譜條件 Waters BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相 0.1% 甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～1 min，10%～40% B；1～3 min，40%～60% B；3～7 min，60%～100% B）；體積流量 0.2 mL／min；柱溫 30 ℃；進樣量 2 μL。

2.3 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正負離子切換掃描；毛細管電壓 3.5／2.5 kV；離子源溫度200 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣體積流量500 L／h；霧化器壓力3.0 V；檢測模式多反應離子監測（MRM）。12種木脂素的質譜分析條件參數見表1，提取離子流色譜圖見圖1。

表1 各成分質譜參數Tab.1 MS parameters of various constituents

圖1 各成分離子流色譜圖Fig.1 Ion current chromatograms of various constituents

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系、檢出限和定量限 取混合對照品溶液，用60%甲醇水溶液逐級稀釋配制成6 個不同質量濃度的混合對照品溶液，在 “2.2”和“2.3”項條件下進樣，以各木脂素成分質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。信噪比S／N=3 時對應的質量濃度作為檢測限，S／N=10 時對應的質量濃度作為定量限。結果見表2，表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4.2 精密度試驗 精密吸取線性中間點質量濃度的混合對照品溶液，在 “2.2”和 “2.3”項條件下，分別連續進樣6 次，記錄12種木脂素成分的峰面積，計算相對標準偏差RSD≤3.07%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 取6 份同一批次的辛夷藥材（批號170201），按 “2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2”和 “2.3”項條件下進樣，計算12種木脂素成分含有量的RSD≤3.17%，表明該方法重復性良好。

2.4.4 穩定性試驗 取批號為170201 辛夷藥材的供試品試液，在 “2.2”和 “2.3”項條件下，于配制后 0、2、4、8、12 和 24 h 進樣，測得各木脂素成分的峰面積，計算其RSD≤2.59%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取9 份已知各木脂素成分含有量的辛夷藥材粉末（批號170201），每份0.5 g，分別精密加入對照品貯備液，使加入量為樣品中各成分含有量的80%、100%、120%，按 “2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2”和 “2.3”項條件下測定各成分含有量，計算加樣回收率，平均加樣回收率為 98.76%～102.32%，RSD 1.89%～2.58% 。

2.5 樣品含有量測定 取各批次廠家的辛夷藥材，按 “2.1.2”項下的方法制備供試品溶液，在“2.2”和 “2.3”項條件下分析，計算各批次辛夷藥材中各成分的含有量，結果見表3。采用 SPSS 19.0 軟件對測定結果進行箱線圖分析，箱線圖是引入P值來評價不同批次間的差異（P=每個批次各化合物含有量／各批次各化合物的平均含有量×100%），P值越接近100% 表明批次間差異越小。結果見圖2，表明4 和12 2種成分批次間差異較大，其余成分P值均在75%至125%之間，差異波動在可接受范圍內。

表3 各成分含有量測定結果（mg／g， n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g， n=3）

圖2 各成分箱線圖Fig.2 Box chart of various constituents

3 討論

在優化提取條件時，本實驗考察了不同溶劑（乙醇、甲醇、乙腈）、不同體積分數（30%、60%、100%）以及不同提取時間（0.5、1、1.5 h），結果表明以60%甲醇水溶液超聲提取1 h，提取效率較高。

在優化色譜條件時，通過改變流動相（水、甲醇、乙腈）不同的組成比例，并添加不同電解質（甲酸、乙酸、甲酸銨），發現以 0.1% 甲酸水溶液-甲醇為流動相進行梯度洗脫時，峰形最佳，在7 min 內可完成12種木脂素類成分的含有量測定。

辛夷中木蘭脂素的含有量遠高于其他成分，桉脂素、epimagnolin、里立脂素 B 二甲醚、3′，4-O-dimethylcedrusin 和辛夷脂素的含有量較高，落葉松樹脂醇-4′-O-β-D-葡萄糖苷、7R?，8S?-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol-4-O-β-D-glucopyranoside、4，4′-dimethoxy-3′-hydroxy-7，9′：7′，9-diepoxylignan-3-O-β-D-glucopyranoside、松 脂 醇、fargesol 和conicaoside 的含有量較低。不同批次間12種成分的含有量具有一定波動，分析與其藥材的生長環境、采收時間以及貯存條件等多種因素相關。

本實驗建立的 UPLC-MS／MS 法可快速、準確地同時測定辛夷中12種木脂素類成分的含有量，MRM 檢測模式與傳統的液相色譜相比，具有更高的選擇性和靈敏度，并且待測化合物無需完全分離即可進行同時準確定量。以期為提高辛夷藥材以及含辛夷中成藥的質量標準提供參考，也為辛夷中木脂素類成分的進一步研究奠定基礎。