杜仲中五環三萜類及其抗腫瘤活性

錢文丹，譚艾娟?，呂世明，陳波利，杜安定，王勝優

（1.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

天然抗腫瘤藥物作為抗腫瘤藥物中的1 個重要分支，必在基礎研究及臨床應用中具有重要的地位。據文獻報道，大多數五環三萜類化合物具有抗腫瘤、抗炎、抗 HIV 等藥理作用。樺木酸是 1種羽扇豆烷型的五環三萜，分布于樺木屬及其他許多屬植物中，是植物的次生代謝產物［1］。在研究中發現，樺木酸本身毒性較低，對正常細胞中的外周血淋巴細胞和皮膚成纖維細胞沒有毒性［2］，其對腫瘤細胞的抑制作用是通過誘導細胞的程序性死亡完成的［3］。課題組從中分離得到3 個化合物，化合物3 之前只在合成產物中所出現過，首次從杜仲中分離得到。選用HeLa 細胞為材料，與化合物1～2比較，著重對化合物3 的抗腫瘤活性機制進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 AVANCE Ⅲ 500 MHz NMR 超導核磁共振波譜儀（德國Brucker 公司）；UPLC-IT-TOF液相-離子阱飛行時間色譜質譜聯用儀（日本島津公司）；Cellomics ArrayScan VTI HCS 高內涵分析儀（美國 Thermo Scientific 公司）；FV1000 激光掃描共聚焦生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Lecia DM55008 熒光顯微鏡（德國 Lecia 公司）；Bio-Rad 680 酶標儀（美國伯樂公司）；ECLIPSE Ts2R 倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）；Agilent 5973 N GCMS LC-MS／MS（美國 Agilent 公司）；CO2細胞恒溫培養箱（美國 Thermo Scientific 公司）；XK96-Ⅰ微量振蕩器（上海化科實驗器材有限公司）；Milli-Q Advantage A10 超純水機（德國默克密理博公司）。超凈工作臺（美國 Thermo 公司）；MLS-3750 型高壓蒸汽滅菌鍋（日本Sanyo 公司）。

1.1.2 細胞與試劑 Hela 細胞株來源于中國科學院西南多樣性實驗室、MDA-MB-231、T47D 細胞株來源于貴州大學生命科學學院。杜仲購于云南省藥材市場。DMEM 培養液、Trypsin EDTA Solution A、FBS、Pen-Strep Solution 購自以色列 Biological Industries 公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國Amresco 公司）；Hoechst 33258、PI、DCFH-DA 試劑盒（美國 Sigma 公司）；Lysotracker Red DND 99、Mito-tracker Red CMXRos（美國 Invitrogen 公司）；正向層析硅膠（80～100 目，300～400 目），及制備型薄層層析硅膠GF254均為青島海洋化工生產；所用MCI gel CHP 20P 為日本三菱化工產品；凝膠色譜為 Sephadex LH-20（美國 GE Healthcare Bio-Xciences AB）；用5% H2SO4乙醇溶液作為常規顯色試劑等。

1.2 方法

1.2.1 提取與分離 選取杜仲的二氯甲烷層經100～200 目硅膠干法裝柱進行劃段，分為10 個組分，并將第 2 個組分利用 Sephadex LH-20 洗脫，最后利用 300～400 目硅膠由純氯仿，氯仿 ∶丙酮（50 ∶1、30 ∶1、20 ∶1、15 ∶1、10 ∶1、3 ∶1）梯度洗脫得化合物1、3 的純品，以及化合物2 的粗提物，將化合物2 經HPLC 分離，得到化合物2的純品。

1.2.2 MTT 法測定細胞毒活性 分別取對數生長期的 Hela 細胞、MDA-MB-231 細胞、T47D 細胞，胰酶消化后用細胞計數儀計數，并用含10% 胎牛血清的培養液配成細胞懸液，以每孔6 000～10 000個細胞分別接種到96 孔細胞培養板，每孔加入100 L 細胞懸液，設置 4 個重復，放置于 37 ℃細胞培養箱過夜培養。待細胞貼壁，加入待測化合物的DMSO 溶液（初篩濃度 40 μmol／L），將有抑制細胞活力的化合物設5 個濃度梯度進行復篩，每種濃度處理均設4 個復孔作為重復對照，順鉑做為陽性藥物，并設置陽性、陰性和空白對照組，培養48 h后，除空白對照組每孔加 MTT（5 mg／mL）溶液100 L，繼續孵育 4 h，每孔加 100 L 的 DMSO 溶液，振蕩 5～15 min。選擇以 570 nm 為波長，酶聯免疫檢測儀讀取各孔光吸收值，利用公式計算化合物對腫瘤細胞活力的抑制［4］。活細胞率=（細胞總數-死細胞數）／細胞總數×100%。采用 GraphPad Prism 5.0 軟件計算化合物對腫瘤細胞的IC50值。

1.2.3 PI，Hoechst 染色測定細胞凋亡 取對數生長期的Hela 細胞計數并配成細胞懸液，選取12 孔細胞培養板，每孔放入蓋玻片，將Hela 細胞接種于蓋玻片上（為了在正置熒光顯微鏡下拍照方便），待細胞長到20%，加不同濃度的化合物處理48 h 后用 PBS 洗滌細胞并用 4% 多聚甲醛固定20 min，用 PBS 洗滌之后加Hoechst 33342（10 μg／mL）和 PI（10 μg／mL）放于細胞培養箱染色30 min，并放于正置熒光顯微鏡下，選紅色和藍色通道的熒光進行拍攝分析。

1.2.4 細胞內源ROS 測定 待培養皿細胞長到對數生長期，用胰酶消化，細胞計數器計數細胞。并將細胞接種于準備好的12 孔細胞培養板中，37 ℃細胞培養箱中放置過夜待細胞貼壁，加入化合物處理24 h（提前1 h 加入陽性對照ROS 活性氧供氫體），每孔加入 DCFH-DA 探針后放于培養箱25～30 min，正置熒光顯微鏡下拍照。

1.2.5 Mito-tracker 染料測定細胞線粒體形態 用激光共聚焦小皿鋪HeLa 細胞，藥物處理24 h 后，以 Mito-tracker 熒光探針按5 000 ∶1 的濃度稀釋并對細胞著色，染完線粒體時需換新鮮培養基讓細胞反吐30 min，并用4%甲醛固定15 min，隨后將甲醛吸掉，加入PBS，最后用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞線粒體形態的變化［5］。

1.2.6 lysotracker 篩選化合物抑制溶酶體酸化和誘導溶酶體生成 在96 孔細胞培養板中加入對數生長期的HeLa 細胞懸液每孔100 μL，待細胞長到80%左右，且在細胞狀態良好的情況下，加入溶解于 DMSO 的化合物至終濃度為 40 μmol／L，放置37 ℃細胞培養箱孵育3～4 h，隨后加入Lysotracker Red DND 99 繼續孵育30 min 后利用高內涵藥物篩選儀測定細胞內紅色熒光強度，并將有效果的化合物進行復篩［6］。將HeLa 細胞懸液計數并加入激光共聚焦小皿，每個小皿加2 mL 細胞懸液，待細胞密度至 70%～80%，加藥處理 3～4 h 后，染色30 min。去除含有 Lysotracker Red DND 99 的培養液，添加新的培養液，并在倒置熒光顯微鏡下，以488 nm為波長進行拍照，從而觀測熒光強度是否增強或減弱［7］。

1.2.7 數據分析 原始數據使用GraphPad Prism 5.0 生成柱狀圖，計算IC50值。所有數據均以（）表示，采用 SPSS 17.0 統計學軟件，組間比較采用單因素方差分析及配對t檢驗，P＜0.05 差異顯著。

2 結果

2.1 結構鑒定

化合物1：核磁共振的13C-NMR 和 DEPT顯示該化合物有30 個碳信號，分別為6 個甲基，11 個亞甲基，6 個次甲基和 7 個季碳。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：4.95（1H，brs，Hβ-29），4.77（1H，brs，Hα-29），3.50（1H，dd，J=15.9，7.4 Hz，H-3），2.25（1H，m，H-19），1.79，0.99，0.97，0.96，0.88，0.85（Me-30，Me-27，Me-23，Me-26，Me-25，Me-24），0.67（1H，d，J=8.7 Hz，H-5）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：C：39.5（C-1），28.7（C-2），78.1（C-3），39.3（C-4），55.9（C-5），18.8（C-6），34.8（C-7），41.1（C-8），51.0（C-9），37.5（C-10），21.2（C-11），26.1（C-12），38.6（C-13），42.9（C-14），31.2（C-15），32.9（C-16），56.7（C-17），47.8（C-18），49.8（C-19），151.4（C-20），30.3（C-21），37.5（C-22），28.3（C-23），14.9（C-24），16.4（C-25），16.4（C-26），14.9（C-27），178.9（C-28），110.0（C-29），19.5（C-30）。以上數據與文獻［8］基本一致，故鑒定為樺木酸。

化合物2：核磁共振的13C-NMR 和 DEPT顯示該化合物有30 個碳信號，分別為7 個甲基，11 個亞甲基，6 個次甲基和 6 個季碳。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：4.88（1H，brs，Hβ-29），4.74（1H，brs，Hα-29），3.34（1H，m，H-3），2.15（1H，m，H-19），1.77（3H，s，Me-30），1.03，0.99，0.97，0.85，0.80，0.79（Me-26，Me-27，Me-23，Me-25，Me-28，Me-24），0.69（1H，d，J=10.0 Hz，H-5）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：C：37.6（C-1），27.6（C-2），78.2（C-3），39.6（C-4），55.9（C-5），18.8（C-6）34.7（C-7），41.3（C-8），50.8（C-9），37.4（C-10），19.3（C-11），25.8（C-12），37.5（C-13），43.0（C-14），27.6（C-15），34.9（C-16），43.0（C-17），48.4（C-18），48.6（C-19），150.1（C-20），30.1（C-21），39.6（C-22），28.3（C-23），16.2（C-24），16.4（C-25），16.5（C-26），15.0（C-27），18.8（C-28），110.0（C-29），19.3（C-30）。以上數據與文獻［8］基本一致，故鑒定為羽扇豆醇。

化合物3：核磁共振的13C-NMR 和 DEPT顯示該化合物有41 個碳信號，分別為7 個甲基，20 個亞甲基，6 個次甲基和 8 個季碳。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：0.84（3H，m，H-11′），0.87（3H，Me-24），0.96（3H，Me-23），1.22（9H，Me-25，Me-26，Me-27），1.27（6H，H-5′，H-6′，H-7′），1.34（6H，H-4′，H-8′，H-9′），1.37（2H，H-10′），1.42（1H，m，H-5），1.64（2H，H-3′），2.21（1H，m，H-19），2.35（2H，H-2′），4.41（1H，dd，J=12.4 Hz，H-3），4.58（1H，brs，Hα-29），4.72（1H，brs，Hβ-29）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：14.3（C-11′），14.9（C-27），16.4（C-24），16.4（C-25），18.8（C-26），18.2（C-6），19.5（C-30），21.2（C-11），22.7（C-10′），24.7（C-12），25.4（C-8′），25.7（C-2），28.7（C-23），29.0（C-4′），29.3（C-5′），29.6（C-6′），29.6（C-7′），30.3（C-21），29.9（C-15），25.0（C-3′），31.9（C-9′），32.0（C-16），34.2（C-2′），35.2（C-7），37.1（C-22），37.5（C-10），37.7（C-4），38.6（C-13），38.6（C-1），40.7（C-8），42.5（C-14），49.3（C-18），48.0（C-19），50.6（C-9），55.5（C-5），56.8（C-17），80.9（C-3），110（C-29），150.3（C-20），173.1（C-1′），181.2（C-28）。以上數據與文獻［9］基本一致，故鑒定為3-O-laurylbetulinic acid。

2.2 MTT 法測定細胞活力 將化合物 1、3 對HeLa 細胞按不同濃度（3.75～60 μmol／L）處理72 h，化合物 2 對 HeLa 細胞按不同濃度（5～80 μmol／L）處理 48 h，見圖1，表明隨著加藥濃度的增加，細胞活力逐漸降低。每一組加藥處理組與陰性對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。化合物 1、3 濃度為 60 μmol／L 時，對 Hela 細胞增殖抑制率分別為 75%、80%；化合物 2 濃度為80 μmol／L 時，抑制率達 86% ，表明化合物 1～3對Hela 細胞有細胞毒活性，且與加藥濃度呈正相關。將化合物 1～3 對 MDA-MB-231、化合物 3 對T47D 細胞按 5～80 μmol／L 的濃度梯度處理 48 h，發現細胞活力按梯度不斷下降，表明化合物1～3對這2 株乳腺癌細胞均有細胞毒活性。由柱狀圖可以看出當這3 個化合物濃度降低至很低時，仍對腫瘤細胞的細胞活力起抑制作用。然而隨著濃度的增高，藥效的增幅卻不十分明顯。化合物1～3 對3株腫瘤細胞的IC50見表1。

圖1 各化合物對Hela、MDA-MB-231、T47D 細胞活力的影響Fig.1 Effects of various compounds on the cell viability of Hela，MDA-MB-231 and T47D cells

表1 抗腫瘤實驗 IC50值（μmol·L-1）Tab.1 IC50 values in antitumor tests（μmol·L-1）

2.3 PI 和 Hoechst 染色 將化合物 1、3 以 30、60 μmol／L的濃度，化合物 2 以 40、80 μmol／L 的濃度處理 HeLa 細胞 48 h，并用 Hoechst 染色。發現隨著時間延長，細胞數量明顯減少，且淡藍色細胞減少，亮藍色細胞增多；并且細胞形態發生了明顯的畸形變化，一些細胞核呈月牙型且邊集化，表明細胞正在啟動凋亡。用PI 染色后，發現隨著濃度加大和時間延長，紅色熒光逐漸增強，表明細胞膜破損的死細胞增加。當化合物1、3 的濃度達到30 μmol／L 時，細胞就開始出現明顯凋亡的現象。化合物 2 在濃度達到 80 μmol／L 時，同樣出現了明顯的凋亡跡象。表明這3 個化合物都能誘導Hela細胞發生凋亡。見圖2。

2.4 DCFH-DA 探針測定 Hela 細胞中 ROS 的生成 由于ROS 的產生是細胞凋亡的早期事件，因此在化合物3 處理24 h 后測定細胞中的ROS。見圖3，隨著化合物3 濃度的增加，綠色熒光增強。與陰性對照組相比，H2O2組及 40 μmol／L 的化合物3 誘導明亮的綠色熒光，表明有大量的ROS 產生，而對照組的ROS 處于基礎水平。結果表明，由于ROS 的過量生成，化合物3 誘導Hela 細胞中線粒體介導的細胞凋亡。

2.5 lysotracker 和Mito-tracker 染料測定溶酶體和線粒體形態 將 HeLa 細胞以 40 μmol／L 的化合物1～3 處理 4 h 后，用 Lysotracker Red DND 99 染料染色0.5 h，并用高內涵藥物篩選儀分析并計算出細胞密度以及熒光強度。化合物1～2 處理組與對照組相比差異顯著（P＜0.05），化合物3 處理組與對照組相比差異極顯著（P＜0.01），通過平均熒光強度的比較，初步判斷，這3 個化合物能抑制溶酶體的酸化，且化合物3 的抑制效果相對較明顯。初步篩選完后，利用激光共聚焦掃描顯微鏡或倒置熒光顯微鏡具體觀察，可發現，加藥組的熒光強度相比對照組明顯降低。由此可判斷這類化合物能抑制溶酶體的生成，且化合物3 的抑制效果相對化合物1～2 更明顯，原因可能是化合物3 相比化合物1～2，空間位阻要更大一些。見圖4。

圖2 各化合物對HeLa 細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of various compounds on apoptosis of HeLa cells

圖3 熒光探針DCF-DA 評估Hela 細胞中ROS 產生Fig.3 Evaluation of ROS generation in Hela cells by the fluorescent probe DCF-DA

圖4 Lysotracker 著色后平均熒光強度Fig.4 Average fluorescence intensity of cells stained with Lysotracker

將 HeLa 細胞以 40 μmol／L 化合物 1～3 處理24 h后，用 Mito-tracker Red 染料染色。可發現加藥處理后的細胞與正常細胞相比，正常細胞線粒體呈絲狀或者絮狀，而化合物處理組線粒體呈顆粒狀，其中化合物2～3 較為明顯，由此可推斷這一類化合物能誘導線粒體形態發生變化。見圖5。

3 討論

圖5 Mito-tracker 探針對HeLa 細胞線粒體的熒光標記Fig.5 Fluorescent labeling of mitochondria in HeLa cells by Mito-tracker probe

天然小分子化合物促進腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤藥物發展的前期基礎研究［10］。近年來，隨著對腫瘤生物學、藥理學研究的深入，天然抗腫瘤藥物逐漸引起了醫學界的廣泛關注。據文獻報道，細胞凋亡的方式主要包括線粒體依賴的凋亡、內質網脅迫誘導凋亡、DNA 損傷及細胞信號轉導引起的凋亡［11］。最新的研究也表明惡性腫瘤的發生、發展以及穩態調控與細胞自噬及溶酶體的調控和功能密切相關［12］，這也是未來研究腫瘤治療的熱點和新方向。溶酶體是細胞內負責降解底物的細胞器，也是信號傳導的重要樞紐［13］。溶酶體功能的缺失會導致諸如溶酶體貯積癥（LSD）和帕金森病等重大疾病［14］。在動物細胞中，溶酶體被認為是內吞途徑的終端消化細胞器，富含大量的酸性水解酶，溶酶體膜蛋白多為糖蛋白，其膜內表面帶負電荷，這對防止細胞自身被消化有重要的意義［15］。

目前靶向治療藥物阿法替尼等在臨床上應用廣泛［16］，具有特異性強、療效顯著、對正常組織損傷小等優勢，但是長期使用會產生明顯的毒副作用和耐藥性，因而人們迫切需要開發機制新穎、作用更強、安全性更高的抗腫瘤藥。據報道，樺木酸類化合物誘導凋亡的作用機制很多，可能直接作用于線粒體而觸發凋亡。樺木酸在細胞游離系統中，經誘導通透性轉變的線粒體，能通過釋放可溶性因子等方式介導caspase-8 和caspase-3 的分裂。文獻中2，3 -羥基樺木酸在體外能使黑色素瘤細胞阻滯在某一生長期，最終導致細胞凋亡［17］。羽扇豆醇酯能夠體外誘導TE-1 細胞凋亡，阻滯細胞周期，其作用機理與下調CyclinD1 和CDK4 的蛋白表達，上調抑癌基因p53 的表達有關。也能有效地抑制人乳腺癌MDA-MB-231 細胞的侵襲和轉移，其機制可能是抑制了核轉錄因子 NF-κB 信號途徑［18］。本實驗以樺木酸及其類似物為研究對象，尋求具有高強度抑制腫瘤細胞生長及促進腫瘤細胞凋亡的化合物結構類型。

4 結論

本實驗從杜仲二氯甲烷提取物中分離得3 個化合物，并對其抗腫瘤活性進行研究。發現均有良好的抗腫瘤活性，經 MTT 法測定其對 HeLa、MDAMB-231、T47D 細胞的細胞活力抑制。又將這 3 個化合物分別進行PI 和Hoechst 染色，發現化合物1、3 達到 30 μmol／L 時，均能有效地誘導腫瘤細胞的凋亡，而化合物2 的活性相對較弱一些。化合物3 能促進細胞內源 ROS 的生成，最后將這3 個化合物分別處理的腫瘤細胞利用Lysotracker Red DND 99 熒光探針染色，這3 個化合物均能抑制溶酶體的生成，其中化合物3 的抑制效果相對較明顯。用Mito-tracker Red 熒光探針標記線粒體，發現這些化合物能促使線粒體形態破碎。通過體外細胞實驗，推斷這類化合物的抗腫瘤作用可能是溶酶體和線粒體依賴的相關途徑。