彌羅松酚在大鼠腦核團內(nèi)的分布

邵敏芳，曹桂云，范 瑛?

（1.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000；2.山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，山東 濟南 250000）

彌羅松酚是從唇形科（如丹參、絨毛栗色鼠尾草、輪葉婆婆納、淡黃香茶菜）或松柏綱（如日本雪松、羅漢松、香榧、側(cè)柏葉）植物中分離得到的松香烷型三環(huán)二萜類化合物，具有多種生物活性，如抗菌［1］、抗氧化［2］、抗癌［3］、抗瘧［4］、保肝［5］、胃腸保護作用［6］，課題組前期研究表明靜脈給藥后該成分可快速進入腦組織進行分布，具有抗帕金森活性，但在腦核團內(nèi)分布的動力學(xué)變化尚不明確，這對治療腦部疾病具有重要的意義。因此，本實驗對彌羅松酚的腦核團分布進行了研究。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），配置手動進樣器、四元梯度泵、DAD 檢測器；MIKRO 22R 臺式冷凍離心機（德國Hettich 公司）；FSH 勻漿機（常州恒隆儀器有限公司）。

1.2 試藥 彌羅松酚由本實驗室從絨毛栗色鼠尾草中分離得到，其結(jié)構(gòu)經(jīng) HPLC、MS 法確認，含有量＞98%。乙腈為色譜純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.3 動物 雄性 Wistar 大鼠，體質(zhì)量 230～250 g，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，動物生產(chǎn)許可證號SYXK（蘇）2012-0029，置于（22±1）℃控溫、光暗周期12 h 環(huán)境下，清潔級普通大鼠飼料飼養(yǎng)。實驗前12 h 禁食不禁水。

2 方法

2.1 對照品溶液制備 精密稱取彌羅松酚對照品2.00 mg，甲醇制成 1.0 mg／mL 貯備液，再稀釋成系列質(zhì)量濃度，即得，密封，置于 4 ℃ 冰箱中備用。

2.2 分組、給藥及采樣 60 只大鼠隨機分為6組，其中 1 組為空白組，另外 5 組為給藥組，按40 mg／kg 劑量尾靜脈注射給藥（溶于蓖麻油-乙醇-水溶液中，比例為 4 ∶10 ∶86），空白組給予相同劑量蓖麻油-乙醇-水溶液。各組于給藥 8、23、45、60、70 min 后處死大鼠，冰盒上迅速取腦并分離海馬、紋狀體、丘腦、下丘腦、大腦皮層、小腦，-20 ℃下冷凍備用。

2.3 樣品預(yù)處理 精密稱取各腦核團組織，加入2 倍量生理鹽水勻漿，勻漿液加入2 倍量乙酸乙酯后渦旋混合 1 min，4 ℃、8 000×g下離心 10 min，取上清液，重復(fù)操作 2 次，合并有機相，45 ℃下N2吹干，殘渣溶于 100 μL 甲醇中，0.45 μm 微孔濾膜過濾。

2.4 色譜條件 YMC ODS C18色譜柱；流動相乙腈-水（85 ∶15）；體積流量 0.8 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長 220 nm；進樣量 20 μL。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察和專屬性試驗 取新鮮空白腦核團勻漿液，加入適量彌羅松酚貯備液，精密配制系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，每條設(shè) 6 個質(zhì)量濃度點，按“2.3”項下方法處理后在 “2.4”項色譜條件下進樣測定。以彌羅松酚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），其峰面積為縱坐標(biāo)（Y），加權(quán)最小二乘法進行回歸，權(quán)重系數(shù)為1／x2，以相關(guān)系數(shù)r來評價相關(guān)性。

2.5.2 最低檢測限（LLOD）、最低定量限（LLOQ）測定 取新鮮空白腦核團勻漿液，加入適量彌羅松酚貯備液，配制成標(biāo)準(zhǔn)曲線末端質(zhì)量濃度，并逐漸降低，分別以檢測成分信號與噪音信號比 3 ∶1、10 ∶1 時的質(zhì)量濃度為 LLOD、LLOQ。

2.5.3 準(zhǔn)確度、精密度試驗 取新鮮空白腦核團勻漿液，加入適量彌羅松酚貯備液，配制成高、中、低 3 個質(zhì)量濃度，平行 3 份，按 “2.3”項下方法處理后在 “2.4”項色譜條件下進樣測定，每個質(zhì)量濃度同1 d 內(nèi)連續(xù)進樣3 次測定峰面積，計算平均值和日內(nèi)精密度；每個樣品連續(xù)3 d 各進樣1 次測定峰面積，計算平均值和日間精密度。

2.5.4 萃取回收率試驗 取新鮮空白腦核團勻漿液，加入適量彌羅松酚貯備液，配制成高、中、低3 個質(zhì)量濃度，平行 3 份，按 “2.3”項下方法處理后在 “2.4”項色譜條件下進樣測定。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取新鮮空白腦核團勻漿液，加入適量彌羅松酚貯備液，配制成高、中、低3 個質(zhì)量濃度，平行3 份，將組織液置于-20 ℃冰箱中冷凍 24 h 后室溫下放置 1 h 解凍，重復(fù) 3 次，按“2.3”項下方法處理后，在 “2.4”項色譜條件下進樣測定。

3 結(jié)果

3.1 彌羅松酚波譜數(shù)據(jù) 白色固體，ESI-MSm／z：287.2［M ＋H］＋，分子式 C20H30O。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：6.83（1H，s，H-14），6.61（1H，s，H-11），3.14（1H，sept，J= 6.6 Hz，H-15），2.84（1H，m，H-7β），2.77（1H，m，H-7α），2.09（1H，m），1.84（1H，m），1.67（2H，m），1.56（1H，m），1.46（1H，m），1.32（2H，m），1.23（3H，d，J=6.6 Hz，17-CH3），1.22（3H，d，J=6.6 Hz，16-CH3），1.14（3H，s，20-CH3），0.94（3H，s，19-CH3），0.91（3H，s，18-CH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：150.7（C-12），148.7（C-9），131.6（C-13），127.3（C-8），126.4（C-14），111.1（C-11），50.4（C-5），41.8（C-3），38.9（C-1），37.5（C-10），33.5（C-4），33.4（C-18），29.8（C-7），26.8（C-15），24.8（C-20），22.9（C-17），22.7（C-16），21.7（C-19），19.4（C-2），19.3（C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻［7］報道基本一致，故鑒定為彌羅松酚。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 專屬性試驗 圖1顯示，在 “2.4”項色譜條件下彌羅松酚保留時間為11.4 min，內(nèi)源性物質(zhì)對其無干擾，方法專屬性良好。

圖1 彌羅松酚HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of ferruginol

3.2.2 線性關(guān)系考察 表1顯示，各腦核團在各自范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r＞0.990 0）。

表1 彌羅松酚線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of ferruginol

3.2.3 LLOD、LLOQ 測定 兩者分別為 0.02、0.06 μg／mL。

3.2.4 準(zhǔn)確度、精密度試驗 表2顯示，彌羅松酚在各腦核團中的日內(nèi)、日間精密度RSD 均小于15%，日間、日內(nèi)準(zhǔn)確度分別為98.26%～108.43%、97.38%～110.22%，表明該方法精密度、準(zhǔn)確度良好。

3.2.5 萃取回收率 表2顯示，彌羅松酚在大鼠腦核團中的萃取回收率在75%以上，符合生物樣品檢測相關(guān)要求。

3.2.6 穩(wěn)定性試驗 表2顯示，彌羅松酚準(zhǔn)確度在91.37%～103.74% 之間，具有良好的凍融穩(wěn)定性。

3.3 腦核團分布 大鼠尾靜脈注射給予40 mg／kg彌羅松酚，于給藥 8、23、45、60、70 min 后分別取海馬、大腦皮層、丘腦、紋狀體、下丘腦、小腦6 個腦核團，HPLC 法測定各腦核團中彌羅松酚含有量，結(jié)果見圖2。由圖可知，靜脈注射給藥后彌羅松酚可透過血腦屏障，在腦核團內(nèi)形成持續(xù)的分布過程；給藥后45 min 左右，大鼠腦核團內(nèi)該成分含有量達到峰值，之后很快下降，峰值濃度依次為紋狀體＞丘腦＞海馬＞大腦皮層＞小腦＞下丘腦，達峰時間差異較小，僅從23 min 到45 min。

表2 彌羅松酚精密度、準(zhǔn)確度、萃取回收率、穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n=3）Tab.2 Results of precision，accuracy，extraction recovery and stability tests for ferruginol（n=3）

圖2 彌羅松酚在腦核團中的峰值濃度Fig.2 Peak concentrations of ferruginol in cerebral nuclei

4 討論

每個腦核團在腦功能中的作用不同，例如海馬體主要負責(zé)學(xué)習(xí)、記憶、空間定位，日常生活中的短期記憶都儲存在其中［8-9］；大腦皮質(zhì)是調(diào)節(jié)或控制軀體運動的最高級中樞［10］；丘腦具有轉(zhuǎn)運站的功能，從脊髓傳來的神經(jīng)沖動都先中止于丘腦，然后再分別傳送至大腦皮質(zhì)相關(guān)區(qū)域［11］，其受損將導(dǎo)致感覺扭曲，從而無法正確了解周圍世界；下丘腦為內(nèi)分泌、神經(jīng)系統(tǒng)的中心，能調(diào)節(jié)垂體前葉功能，合成神經(jīng)垂體激素，控制自主神經(jīng)和植物神經(jīng)功能［12］；紋狀體與隨意運動的穩(wěn)定、肌張力的維持、肢體姿勢的調(diào)節(jié)活動有關(guān)，此外還與對本體感受器傳入的信息處理，即與無意識的運動反射控制有一定聯(lián)系［13-14］，根據(jù)臨床、病理學(xué)觀察，紋狀體不同部位的損害可產(chǎn)生帕金森病［15-16］、舞蹈病、手足徐動癥等［17-19］，故動態(tài)觀察藥物在腦內(nèi)不同核團內(nèi)的分布對探討其對腦功能的影響有著重要意義，也可指導(dǎo)相應(yīng)藥物開發(fā)。

本實驗發(fā)現(xiàn)，彌羅松酚靜脈注射后在海馬、大腦皮層、丘腦、紋狀體、下丘腦、小腦中均有分布，其中在紋狀體、丘腦中有富集傾向。該成分對治療腦部疾病可能有一定的作用，但對大腦的影響較復(fù)雜，提示在設(shè)計中樞治療藥物時要充分考慮具體腦核團分布規(guī)律，從而得到較好的藥效和較低的副作用。