左金丸活性成分-靶點-多維作用機制

李躍文，劉志強，易增興，秦后響，王博龍

（宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000）

左金丸始載于元代著名醫(yī)家朱震亨所撰 《丹溪心法》，由黃連、吳茱萸用量按6 ∶1 比例組成，以水丸或湯劑入藥，具有清肝瀉火、降逆和胃、開郁散結(jié)等功效，臨床大多用于胃炎、食道炎、胃潰瘍等屬肝火犯胃者。現(xiàn)代藥理研究［1-4］發(fā)現(xiàn)，左金丸中黃連、小檗堿可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；小檗堿起到質(zhì)子泵抑制劑，即H＋／K＋-ATP 酶抑制劑的作用，從而抑制胃酸分泌；小檗堿、吳茱萸次堿直接拮抗膽堿受體或抑制膽堿酯酶的活性，具有抑制小鼠胃腸道蠕動的作用，還可抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生和分泌，從而發(fā)揮抗炎作用，故該制劑臨床應(yīng)用也擴展到腫瘤、炎癥等疾病的治療［5］。然而，左金丸主要藥效成分、靶標(biāo)、通路，以及治療不同疾病的分子機制迄今仍不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)為理論基礎(chǔ)，通過構(gòu)建藥物-靶點-疾病之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)來探討藥物作用機制，其研究方法的整體性、系統(tǒng)性非常適合于研究多組分、多靶點的中藥及其復(fù)方，為挖掘中藥藥效物質(zhì)及其作用機制，闡述復(fù)方配伍規(guī)律及一方多效提供了新的途徑與方法［6-8］，已成為中藥及其復(fù)方研究中的熱點［9］。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探索左金丸主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與靶標(biāo)、疾病的相互作用關(guān)系，以期系統(tǒng)、全面地闡述其機制。

1 資料與方法

1.1 中藥活性成分收集與篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺TCMSP 數(shù)據(jù)庫收集左金丸中黃連、吳茱萸的主要化學(xué)成分，以 OB ＞30%、DL ＞0.18作為其活性成分篩選條件。其中，口服生物利用度（OB）指的是藥物有效成分或活性基被吸收到達(dá)體循環(huán)并被吸收的速度與程度，類藥性（DL）指的是藥物包含一些特定功能基團(tuán)或具有與大多藥物相同或相似的物理特征，兩者為中藥成分吸收、分布、代謝、排泄（ADME）的關(guān)鍵參數(shù)。同時結(jié)合文獻(xiàn)最終確定左金丸活性成分。

1.2 左金丸活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 TCMSP 數(shù)據(jù)庫提供了潛在活性分子的靶點（包括Drugbank 數(shù)據(jù)庫中6 511 個藥物分子、3 987 個與已知化合物相互作用的蛋白質(zhì)），通過該數(shù)據(jù)庫提取活性成分的作用靶蛋白，UniProt、GeneCards 數(shù)據(jù)庫篩選出物種為 “人”的對應(yīng)靶基因，從而獲得其活性成分的對應(yīng)靶基因。然后，運用Cytoscape 軟件將TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出的左金丸活性成分與其潛在靶點構(gòu)建 “左金丸活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，“Network Analyzer”插件分析該網(wǎng)絡(luò)圖的拓?fù)鋵傩裕罁?jù)其 “節(jié)點度值分布、介數(shù)中心性”2 個重要網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)來篩選左金丸主要活性成分。

1.3 左金丸靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過TTD 數(shù)據(jù)庫找尋左金丸靶點潛在治療疾病，Cytoscape 軟件構(gòu)建左金丸靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將左金丸靶蛋白導(dǎo)入 STRING 數(shù)據(jù)庫，將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”后進(jìn)行操作，最低相互作用閥值設(shè)為中等 “medium confidence”，其余參數(shù)均保持默認(rèn)，構(gòu)建左金丸靶蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI network），結(jié)果保存成TSV 格式并導(dǎo)入 Cytoscape，再利用 “Network Analysis”功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩苑治觯瑢⒍戎怠⒔閿?shù)均排序在前20 的靶蛋白建立交集，篩選左金丸關(guān)鍵靶蛋白。

1.5 GO 生物過程與KEGG 通路富集 利用Cytoscape 軟件中的 “BiNGO”插件對左金丸靶基因進(jìn)行GO 生物過程富集，并應(yīng)用 “MCODE”插件對所有具有統(tǒng)計學(xué)意義（P-value＜0.05）的 GO 生物過程進(jìn)行聚類分析，并對各子簇進(jìn)行注釋；利用DAVID6.8 平臺對左金丸進(jìn)行KEGG 通路富集，設(shè)定閾值P-value＜0.05，研究相關(guān)靶點參與的主要信號通路。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選 依據(jù)DL＞0.18、OB＞30%的原則，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中篩選出11種活性成分，另外黃連中藥根堿、非洲防己堿OB 值雖然相對較低，但文獻(xiàn)［5，10-11］報道兩者也是該藥材活性物質(zhì)，最終篩選出 13種，見表1。

表1 左金丸中活性成分Tab.1 Active ingredients in Zuojin Pills

2.2 活性成分-靶點分析 以左金丸中13種活性成分和49 個靶點構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），各節(jié)點度值、介數(shù)中心性分布見圖2～3，可知兩者平均值分別為6、0.02。由圖1 可知，吳茱萸次堿、藥根堿、吳茱萸堿、非洲防己堿、小檗堿、巴馬汀6種成分的度值、介數(shù)均超過了平均值，可能是左金丸中活性成分，見表2。

圖1 左金丸活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Active ingredients-targets network of Zuojin Pills

圖2 度值分布（Ⅰ）Fig.2 Degree value distribution（Ⅰ）

2.3 靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)分析 以左金丸具有疾病治療作用的32 個靶點構(gòu)建靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖（圖4），可知在消化、神經(jīng)、心血管系統(tǒng)疾病，以及炎癥、癌癥等方面具有治療價值，呈現(xiàn)出多維藥理作用。

圖3 介數(shù)中心性分布（Ⅰ）Fig.3 Betweenness centrality distribution（Ⅰ）

2.4 靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 將左金丸49 個靶蛋白在STRING 平臺進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)有47 個節(jié)點蛋白（2 個靶蛋白未參與蛋白互作），207 條相互作用連線，其度值、介數(shù)中心性分布見圖5～7。再將兩者均排序在前20 的靶蛋白建立交集，篩選出度值高、介數(shù)大者有 15 個，見表3，可知它們是PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點，即為左金丸發(fā)揮藥理作用的關(guān)鍵靶點。

圖4 左金丸靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Targets-diseases network of Zuojin Pills

表2 活性成分拓?fù)鋮?shù)Tab.2 Topological parameters for active ingredients

2.5 GO 生物過程富集 應(yīng)用 “BiNGO”插件對49 個靶點進(jìn)行GO 生物過程富集，最終得到P＜0.05 的 GO 條目 1 092 個，再通過 “MCODE”插件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見表4，共發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、一氧化氮生物合成與代謝、突觸傳遞、細(xì)胞周期與分化、前列腺素合成與代謝等19 個主要子簇。

圖5 靶蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.5 PPI network of target proteins

2.6 KEGG 信號通路分析 將左金丸49 個靶基因在KEGG 信號通路富集，以P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選，得到22 條主要信號通路，包括3 條消化液分泌相關(guān)通路，消化液分泌、胃酸分泌、胰腺分泌；5 條癌癥相關(guān)通路，癌癥通路、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌；2 條內(nèi)分泌通路，雌激素信號通路、甲狀腺激素信號通路；3 條神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)通路，5-羥色胺能神經(jīng)突觸、神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路、膽堿能突觸；1 條炎癥通路，腫瘤壞死因子信號通路；4 條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，PI3K-Akt 信號通路、cAMP 信號通路、鈣信號通路、T 細(xì)胞受體信號通路；4 條心血管通路：心肌細(xì)胞腎上腺素能信號、血管平滑肌收縮、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、血小板激活。見表5、圖8。

圖6 度值分布（Ⅱ）Fig.6 Degree value distribution（Ⅱ）

圖7 介數(shù)中心性分布（Ⅱ）Fig.7 Betweenness centrality distribution（Ⅱ）

表3 關(guān)鍵靶點與拓?fù)鋮?shù)Tab.3 Key targets and topological parameters

表4 子簇注釋及中心GO 條目Tab.4 Sub-cluster comments and central GO entries

續(xù)表4

續(xù)表4

表5 KEGG 信號通路Tab.5 KEGG signaling pathways

圖8 KEGG 信號通路富集Fig.8 Enrichment of KEGG signaling pathways

3 討論

本研究利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選得到左金丸13個活性成分及49 個對應(yīng)靶點，并構(gòu)建左金丸活性成分-靶點、靶點-疾病、PPI 網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)吳茱萸次堿、藥根堿、吳茱萸堿、非洲防己堿、小檗堿、巴馬汀 6種成分，以及 ESR1、TNF、AR、NOS3、PTGS2、CDK2、MMP9、MMP2、NOS2、IL4 等 15個靶點的度值、介值均較靠前，可能是左金丸主要藥效物質(zhì)及其關(guān)鍵作用靶點。左金丸中小檗堿、巴馬汀、黃連堿、甲基黃連堿、藥根堿、表小檗堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿等生物堿具有減少胃酸分泌、促進(jìn)潰瘍愈合的作用［12］，與本研究預(yù)測得到的主要藥效物質(zhì)，以及疏肝瀉火、和胃止痛的功效主治基本一致，其中吳茱萸次堿不僅能抗膽堿能神經(jīng)，抑制胃腸道運動亢進(jìn)，還可抑制環(huán)氧合酶2（COX-2）的活性或花生四烯酸釋放，減少炎性介質(zhì)前列腺素 E（PGE）的合成而抗炎［13］；吳茱萸堿可通過抑制 NF-κB（p65）蛋白表達(dá)，降低 TNF-α 水平，從而發(fā)揮腸黏膜保護(hù)作用［14］；小檗堿則可顯著抑制 IL-6、TNF-α 分泌，減輕由內(nèi)脂素誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并改善肥胖小鼠胰島素抵抗和糖代謝異常［15-16］。周祥羽等［17］發(fā)現(xiàn)，左金丸能顯著升高胃熱證大鼠血清中IL-10、B 細(xì)胞淋巴瘤因子 2（Bcl-2）水平，降低 IL-2、IL-6、IL-1β、NO 水平，從而減少胃熱證大鼠胃黏膜損傷面積；易文等［18］報道，左金丸可通過抑制肝郁脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎患者分泌 NOS2、NO、TNF-α、IL-1β 等促炎因子，促進(jìn)其分泌 IL-4、IL-10 等抗炎因子，從而恢復(fù)促炎因子和抗炎因子之間的平衡，與本研究中GO 生物過程、KEGG 信號通路富集顯示左金丸參與NO 生物合成和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)相吻合；尹抗抗等［19］指出，左金丸能明顯抑制胃酸分泌，提高胃液pH 值，降低胃潰瘍指數(shù)，從而抑制大鼠應(yīng)激性胃潰瘍的發(fā)生；林科名等［20］研究表明，左金丸乙醇提取物還能降低應(yīng)激性胃潰瘍大鼠腦組織中去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）、多巴胺及腎上腺組織中NE 等單胺神經(jīng)遞質(zhì)濃度，通過神經(jīng)體液途徑發(fā)揮抗應(yīng)激性胃潰瘍的作用；本研究中KEGG 信號通路富集顯示左金丸不僅作用于胃酸分泌、胰腺分泌、消化液分泌信號通路，影響整個消化道腺體分泌，還參與5-羥色胺能神經(jīng)突觸、膽堿能神經(jīng)突觸、神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路等神經(jīng)遞質(zhì)、胃腸道遞質(zhì)信號通路，這可能是其抑制胃酸、胰液等消化液分泌，促進(jìn)潰瘍愈合，調(diào)節(jié)胃腸蠕動，治療中醫(yī)之脘脅疼痛，口苦嘈雜，嘔吐酸水的肝火犯胃證，以及西醫(yī)多種胃炎、膽囊炎、消化性潰瘍、功能性消化不良等［21-22］胃腸疾病的藥理基礎(chǔ)。

左金丸靶點KEGG 富集集中的另一個領(lǐng)域是癌癥，主要有癌癥通路、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌5 條，表明它在癌癥治療方面具有潛在價值。目前已確認(rèn)的抗癌活性成分有小檗堿和吳茱萸堿［10］，其中前者不僅抑制 EGFR、ERBB2、FGFR1、MET、VEGFR2 等多個酪氨酸激酶受體激活，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡或周期停滯，抑制癌細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移，增強腫瘤細(xì)胞化療敏感性，還能調(diào)控 P13 K／AKT 通路，抑制 MMP2、MMP9 表達(dá)，有效降低肺腺癌細(xì)胞A549 細(xì)胞、膀胱癌T24 細(xì)胞的遷移侵襲能力，從而產(chǎn)生腫瘤防治作用［23-27］；后者可通過調(diào)節(jié)M 期阻滯與滑移，上調(diào)a-SMase 表達(dá)，誘導(dǎo)人胃 癌 SGC-7901 細(xì)胞凋亡［28］。杜 佳等［29］發(fā)現(xiàn)，左金丸含藥血清可通過調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞 CDK2、CDK4、Cyclin D1、Cyciln E 等周期相關(guān)蛋白，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，與本研究中左金丸GO 富集得到細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等生物子簇相吻合。

另外還發(fā)現(xiàn)，左金丸能作用于心肌細(xì)胞腎上腺素能信號、血管內(nèi)皮生長因子、血小板激活等心血管相關(guān)信號通路，表明其具有治療心血管疾病的潛在價值。林晶晶等［30］報道，吳茱萸堿、吳茱萸次堿具有降血脂、抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血壓、保護(hù)心臟等心血管藥理作用；小檗堿不僅能抑制血小板聚集，減少血液黏稠度，抑制血栓形成，預(yù)防心腦血管疾病，還可減少心肌細(xì)胞膜上的α 腎上腺素受體數(shù)，抑制心肌細(xì)胞鈣內(nèi)流，阻斷細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)心肌細(xì)胞［31-33］。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究左金丸，闡述了其治療消化系統(tǒng)疾病、癌癥、循環(huán)系統(tǒng)疾病的活性成分、靶點、多維作用機制，為今后相關(guān)研究提供思路與線索，也為拓展該制劑臨床應(yīng)用奠定理論依據(jù)。