黃芪多糖對非酒精性脂肪性肝炎大鼠ACE2-［Ang-（1-7）］-Mas 軸及胰島素抵抗的影響

馬燕花，邱曉青，師 霞，余臣祖

（1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730020）

非酒精性脂肪性肝病是一種與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關的代謝應激性肝臟損傷，疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相關肝硬化和肝細胞癌［1-2］，該疾病由于可進展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等終末期肝病，一直備重視。研究表明，非酒精性脂肪性肝病小鼠有明顯的胰島素抵抗［3］，其所致肝細胞內甘油三脂蓄積被認為是重要致病因素。胰島素受體底物-1（IRS-1）是胰島素信號轉導途徑中的重要因子，在胰島素抵抗中起到重要作用［4］。

腎素血管緊張素系統（RAS）存在對立、統一的2 條軸：血管緊張素轉換酶（ACE）-血管緊張素Ⅱ（1-8）［AngⅡ（1-8）］-血管緊張素Ⅱ 1 型受體（AT1）軸、血管緊張素轉換酶 2（ACE2）-血管緊張素（1-7）［Ang-（1-7）］-［Ang-（1-7）］受體（MAS）軸［5］。研究表明［6-8］，AngⅡ參與并促進胰島素抵抗發生，而 ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸作為RAS 的一個負調節軸，對胰島素抵抗的發生有抑制作用［9］。本實驗用黃芪多糖對非酒精性脂肪性肝炎大鼠進行干預，探討其對ACE2-Ang-（1-7）-Mas 軸及胰島素抵抗的影響，進一步闡明該成分的分子生物學機制，為相關臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性 SD 大鼠 40 只，體質量180～220 g，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供，許可證號 SCXK（甘）2015-0001，動物飼養于甘肅中醫藥大學實驗動物中心，室內溫度（22±2）℃左右，相對濕度 50%～60%左右，12 h 光照維持，晝夜循環，適應性喂養1 周，自由攝食飲水，普通飼料喂養。本實驗遵循甘肅中醫藥大學實驗動物中心實驗動物使用管理規定，并通過甘肅中醫藥大學動物倫理委員會批準。

1.2 試藥 黃芪多糖購自南京澤朗生物科技有限公司，含有量90.11%。鹽酸吡格列酮由北京太洋藥業股份有限公司生產，規格 15 mg，7 片／盒，批號161101，購自甘肅中醫藥大學附屬醫院。高脂飼料由北京科澳協力飼料有限公司提供（普通飼料＋15% 豬板油＋1% 膽固醇＋10% 蛋黃粉＋0.2% 膽酸鈉），真空包裝成10 kg／袋。丙氨酸氨基轉移酶（ALT，批號 13352801）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST，批號 14640501）、總膽固醇（TC，批號13585401）、甘油三酯（TG，批號 14854801）試劑盒均購自德國羅氏公司；MDA（批號 s0131）、SOD（批號s0101）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Ang1-7 ELISA 檢測試劑盒（批號RA036）購自上海歌凡生物科技有限公司；DEPC（批號 E174）購自美國 Amresco 公司；Trizol（批號9109）、qPCR 反應試劑盒（批號 RR420 A）、反轉錄試劑盒（批號RR047 A）購自日本TakaRa 公司；ECL 發光液、PVDF 膜購自美國 Millopore 公司；羊抗IgG 抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；ACE2（批號 ab108252）、IRS-1（批號 ab131487）、MAS（批號 ab200685）一抗均購自英國 Abcam 公司；β-actin 購自美國 CST 公司。

1.3 儀器 iMark 酶標儀、Western blot 轉膜儀、電泳儀（美國 Bio-Rad 公司）；Mx3005P 實時定量PCR 擴增儀（美國 Agilent 公司）；NanoDrop 2000超微量分光光度計（美國Thermo 公司）。

2 方法

2.1 造模及分組 高脂飼料建立非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型。大鼠常規喂養7 d 后，隨機分為正常組［普通標準飼料（總熱量15.335 J／g，碳水化合物占53%，脂肪占 9%，蛋白質占 20%）］、造模組（高脂飼料），第12 周末隨機處死造模組大鼠2 只，取出肝臟作病理切片，發現模型建立成功。將造模成功大鼠（30 只）隨機分為模型組、黃芪多糖組、吡格列酮組［10］，每組 10 只，灌胃給藥，其中黃芪多糖組［11-12］劑量為 400 mg／kg 灌胃，吡格列酮組劑量為 20 mg／kg，正常組、模型組為等容量生理鹽水，灌胃體積1 mL／100 g，各組大鼠飲食不變，連續給藥 4 周，1 次／d，觀察大鼠進食、飲水、行為、活動、精神狀態、毛發、大小便等情況，每1 周記錄動物體質量1 次，持續至16周。然后，大鼠禁食 24 h，次日腹腔注射 10% 水合氯醛麻醉，下腔靜脈取血，3 000 r／min 離心15 min，分離血清，-20 ℃下保存，迅速取出肝臟，稱定肝濕重，-80 ℃下冷凍保存。

2.2 肝指數檢測 實驗結束時稱定大鼠體質量和肝濕重，肝指數=（肝濕重／體質量）×100%。

2.3 血清肝功能、血脂指標檢測 全自動生化分析儀檢測 ALT、AST、TG、TC 水平，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD 水平，硫代巴比妥酸法檢測 MAD水平。

2.4 血清 Ang（1-7）水平檢測 取待測血清50 μL，加入 ELISA 試劑盒檢測孔中，根據說明書進行操作，酶標儀于450 nm 波長下測定吸光度（A），結合標準曲線計算檢測血清 Ang（1-7）水平。

2.5 肝臟組織病理學變化觀察 取部分大鼠肝組織，4%多聚甲醛固定，常規制備組織石蠟切片，HE 染色，光鏡下進行觀察。

2.6ACE2、Mas、IRS-1 mRNA 表達檢測 采用RT-PCR 法。取 100 mg 左右大鼠肝組織，Trizol 法提取總RNA，超微量分光光度計測定樣品質量濃度（ng／μL），測得A260nm／A280nm比值在1.8～2.1 之間，提示 RNA 質量較好，取 1 μg RNA 樣品用于合成cDNA。按照RT-PCR 試劑盒說明書操作步驟對ACE2、Mas、IRS-1 進行 PCR 擴增，三者 mRNA 檢測所需引物均根據標準RT-PCR 引物設計原則，由大連寶生物工程有限公司設計并合成（表1）。采用兩步法 PCR 反應程序（體積 25 μL），第一步95 ℃ 30 s；第二步 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，44 個循環，靶基因相對表達量用 2-ΔΔCt計算。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.7 ACE2、Mas、IRS-1 蛋白表達檢測 采用Western blot 法。取20 mg 左右冷凍的大鼠肝臟組織樣本，剪碎，加入RIPA 組織裂解液提取各組肝組織總蛋白，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，取 40 μg 蛋白，10%SDS-PAGE 分離后電轉運至PVDF 膜上，置于2%酪蛋白溶液中，室溫下振搖 1.5 h，加入兔抗鼠 ACE2、兔抗鼠 Mas，兔抗鼠 β-actin 單抗（1 ∶1 000 稀釋），4 ℃ 下孵育過夜；TBST 洗膜 3 次，加入二抗室溫孵育 1 h，加入HRP 標記的山羊抗兔 IgG（1 ∶2 000 稀釋），再洗膜3 次，加入 ECL 發光液壓片顯影，掃描攝取圖像。然后，用Quantity one 軟件分析條帶的灰度值，以 ACE2、Mas、IRS-1 與 β-actin 灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

2.8 統計學分析 通過SPSS 19.0 進行處理，數據以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 肝指數 表2顯示，與正常組比較，模型組肝指數顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪多糖組肝指數均顯著下降（P＜0.01）。

表2 黃芪多糖對肝指數的影響（， n=10）Tab.2 Effects of Astragali Radix polysaccharides on liver indices（， n=10）

表2 黃芪多糖對肝指數的影響（， n=10）Tab.2 Effects of Astragali Radix polysaccharides on liver indices（， n=10）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，▲▲P＜0.01

組別 體質量／g 肝濕重／g 肝指數／%正常組 287.63±75.82 10.43±2.70 3.64±0.18模型組 272.20±71.42 11.53±2.89 4.29±0.41#黃芪多糖組 296.20±66.57 6.87±0.97 2.36±0.23▲▲吡格列酮組 303.90±88.71 7.50±1.92 2.50±0.20▲▲

3.2 血清指標 表3顯示，與正常組比較，模型組 ALT、AST、TC、TG、MDA、Ang1-7 水平顯著升高（P＜0.05），SOD 水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，黃芪多糖組 ALT、AST、TC、TG、MDA 水平顯著降低（P＜0.01），Ang1-7、SOD 水平顯著升高（P＜0.01）。

3.3 肝臟組織病理學變化 圖1顯示，正常組大鼠肝組織肝小葉結構完整，肝索、肝竇分布正常，肝細胞形態一致，未見明顯變性壞死，小葉內及匯管區未見明顯淋巴細胞浸潤；模型組大鼠肝組織肝小葉結構完整，肝索明顯增寬，肝竇融合，可見肝細胞彌漫性脂肪變，部分區域匯管區及小葉內少量淋巴細胞浸潤；與模型組相比，黃芪多糖組、吡格列酮組大鼠肝組織脂肪變及炎癥反應明顯減輕，僅少數區域肝細胞內見極少量大小不等脂肪空泡，匯管區及小葉內未見明顯淋巴細胞浸潤。

3.4ACE2、Mas、IRS-1 mRNA 表達 表4顯示，與正常組比較，模型組ACE2、MasmRNA 表達顯著升高（P＜0.01），IRS-1 mRNA 表達顯著降低（P＜ 0.05）；與模型組比較，黃芪多糖組三者mRNA 表達顯著升高（P＜0.01）。

表3 黃芪多糖對血清指標的影響（， n=10）Tab.3 Effects of Astragali Radix polysaccharides on serum indices（， n=10）

表3 黃芪多糖對血清指標的影響（， n=10）Tab.3 Effects of Astragali Radix polysaccharides on serum indices（， n=10）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01

組別 ALT／（U·L-1）AST／（U·L-1）TC／（mmol·L-1）TG／（mmol·L-1 ）SOD／（U·mL-1）MDA／（μmol·L-1）Ang1-7／（ng·L-1）正常組 32.40±2.67 120.80±13.61 1.53±0.27 0.63±0.13 423.76±22.46 11.91±1.54 0.08±0.01模型組 44.35±10.53# 182.60±70.16# 1.89±0.22# 1.07±0.29## 131.00±11.22## 30.96±1.19## 0.35±0.04##黃芪多糖組 27.91±8.04▲▲ 115.10±19.33▲▲ 1.46±0.16▲▲ 0.34±0.09▲▲ 328.84±34.45▲▲ 17.55±2.67▲▲ 1.30±0.14▲▲吡格列酮組 26.33±7.46▲▲ 96.55±52.71▲▲ 1.46±0.31▲▲ 0.48±0.08▲▲ 395.89±39.53▲▲ 16.32±1.51▲▲ 1.17±0.07▲▲

圖1 各組大鼠肝臟組織病理學變化（HE，×40）Fig.1 Liver histopathological changes of rats in various groups（HE，×40）

表4 黃芪多糖對 ACE2、 Mas、 IRS-1 mRNA 表達的影響（， n=10）Tab.4 Effects of Astragali Radix polysaccharides on ACE2， Mas and IRS-1 mRNA expressions（，n=10）

表4 黃芪多糖對 ACE2、 Mas、 IRS-1 mRNA 表達的影響（， n=10）Tab.4 Effects of Astragali Radix polysaccharides on ACE2， Mas and IRS-1 mRNA expressions（，n=10）

注：與正常組比較，# P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01

組別 ACE2 Mas IRS-1正常組 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型組 2.51±0.47## 2.60±0.23## 0.6071±0.004#黃芪多糖組 3.97±0.36▲▲ 6.12±0.43▲▲ 6.115±0.155▲▲吡格列酮組 7.96±0.54▲▲ 6.38±0.49▲▲ 1.349±0.00848▲▲

3.5 ACE2、Mas、IRS-1 蛋白表達 表5、圖2顯示，與正常組比較，模型組 Mas、ACE2 蛋白表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），IRS-1 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪多糖組三者蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。

4 討論

非酒精性脂肪性肝炎的發生與胰島素抵抗密切相關，被認為是代謝綜合征的肝臟表現［13］，胰島素的代謝功能主要通過磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3k）信號途徑實現，它通過與胰島素受體結合來使后者底物蛋白（IRS）磷酸化，進一步激活PI3k，并導致蛋白激酶B（Akt／PKB）磷酸化而發揮胰島素生物學效應［14］。IRS 是 1種具有胰島素受體蛋白酪氨酸激酶活性的、結構相似的信號蛋白，主要包括IRS-1、IRS-2，其中前者表達于肝臟、骨骼肌等組織，是胰島素信號轉導途徑中的重要因子，在胰島素抵抗中起著重要作用［15］。

表5 黃芪多糖對ACE2、Mas、IRS-1 蛋白表達的影響（，n=10）Tab.5 Effects of Astragali Radix polysaccharides on ACE2，Mas and IRS-1 protein expressions（，n=10）

表5 黃芪多糖對ACE2、Mas、IRS-1 蛋白表達的影響（，n=10）Tab.5 Effects of Astragali Radix polysaccharides on ACE2，Mas and IRS-1 protein expressions（，n=10）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 ACE2 Mas IRS-1正常組 0.68±0.09 0.80±0.01 0.97±0.06模型組 1.30±0.28## 0.94±0.09# 0.84±0.03#黃芪多糖組 1.68±0.12▲ 1.09±0.07▲ 0.96±0.03▲吡格列酮組 1.77±0.23▲ 1.42±0.03▲▲ 1.04±0.10▲▲

ACE2 是 2000年由 Donoghue［16］、Tipnis［17］研究小組發現的RAS 家族新成員，其主要生物學作用是水解AngⅠ、AngⅡ，從而產生降解產物Ang-（1-7），它主要分布在血管、心臟、腎臟、肝臟，與其特異性受體MAS 結合而發揮生物學作用，Mas受體由Mas 原癌基因編碼，屬于7 次跨膜的G 蛋白偶聯受體，表達于人類及大鼠心臟、腎臟、肝臟、脂肪組織、睪丸、骨骼肌、視網膜色素上皮等部位，正常肝臟中 ACE2-Ang-（l-7）-Mas、ACEAngⅡ-AT1R 系統均有表達［18］，而當肝臟損傷時兩者均表現為表達上調。研究表明，非酒精性脂肪性肝炎大鼠經AngⅡ處理后胰島素抵抗程度明顯加重，而敲除AT-1 受體或給予ARB 預處理后明顯減輕［19］，AngⅡ可通過促進胰島素受體絲氨酸磷酸化，抑制IRS-1 酪氨酸磷酸化，從而降低胰島素敏感性［20］；ACE2-Ang（1-7）-Mas 系統 通 過 促使IRS-1 磷酸化來激活 PI3k 信號轉導通路，降低血脂、改善胰島素抵抗［21-22］。研究表明，Ang-（1-7）轉基因大鼠血脂水平明顯降低，胰島素敏感性增強［23］，而且Mas 基因敲除小鼠出現血脂水平升高、胰島素抵抗［24-25］。

圖2 各組 Mas（a）、ACE2（b）、IRS-1（c）蛋白表達Fig.2 Mas（a），ACE2（b）and IRS-1（c）protein expressions in various groups

黃芪作為傳統中藥材，具有扶正補氣之功效，黃芪多糖是其重要的天然有效成分，具有 扶正固本、補中益氣、化痰祛脂功效［26］，可降低血脂，增加胰島素敏感性［27］，但其具體降脂護肝機制尚不明確。本實驗用黃芪多糖對非酒精性脂肪性肝炎大鼠進行治療，觀察其對 ACE2-Ang-（l-7）-Mas系統及IRS-1 表達的影響，發現模型大鼠血清轉氨酶、血脂、Ang-（l-7）水平明顯升高，肝組織ACE2、Mas 表達明顯增加，IRS-1 表達明顯減低，而黃芪多糖干預后大鼠血清轉氨酶、血脂明顯降低，Ang-（l-7）水平及 ACE2、Mas、IRS-1 表達模型提高，病理學檢查顯示，肝組織脂肪變性明顯減輕。由此可知，黃芪多糖能顯著改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠胰島素抵抗，具有很好的降脂、保肝作用，其機制可能與上調 ACE2、Mas、Ang-（l-7）水平，進而促進IRS-1 磷酸化有關。