通腑泄濁法對慢性腎臟病大鼠TGF-β1／p38MAPK信號通路的調節作用

于 翔，戴銘卉，劉 猛，包 能，孔 薇?

（1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210046；2.南京中醫藥大學附屬南京中醫院，江蘇 南京 210001）

腎臟纖維化是各種腎臟疾病進入終末期的必經過程，故延緩其進展對治療慢性腎臟病而言具有重要意義。轉化生長因子-β1（TGF-β1）／促分裂素原活化蛋白激酶（p38MAPK）是腎臟纖維化過程中重要的信號通路，其中前者不僅作為上游因子參與激活后者信號通路，同時活化的后者信號通路會誘導反向產物前者生成增多，故阻斷該信號通路對延緩慢性腎臟病病程進展具有重要意義。

通腑泄濁法是臨床常用治療慢性腎臟病的中醫療法，通腑泄濁方是南京市中醫院腎內科協定方，由生大黃、生牡蠣、熟附子、蒲公英、生槐米、六月雪組成，該方以 《黃帝內經》 中 “開鬼門，潔凈府”的理論為治療原則，緊扣 “濁毒”病機，結合傳統方義和現代藥理，以大黃為君藥，結合諸藥共奏清熱利濕、通腑泄濁之功效。本實驗選用通腑泄濁方及大黃作為通腑泄濁法代表方劑，觀察該方法對 TGF-β1／p38MAPK 信號通路的影響及對腎臟纖維化的改善作用。

1 材料

1.1 動物 SPF 級 8 周齡雄性 SD 大鼠 30 只，體質量（200±20）g，購自浙江省動物實驗中心［許可證號 SCXK（浙）2014-0001］，飼養于南京中醫藥大學動物中心［許可證號 SYKX（蘇）2014-0001］，自由攝食飲水，封閉管理。實驗前，適應喂養1 周。

1.2 試藥 腺嘌呤（美國 Amresco 公司，批號0183）。大黃、牡蠣、附子、蒲公英、槐米、六月雪配方顆粒（江陰天江藥業有限公司）。α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA，批號 ab5694）、Ⅰ型膠原蛋白（Col-Ⅰ，批號 ab34710 ）、GAPDH（批號ab181602）抗體及大鼠胱抑素 C ELISA 試劑盒（批號 ab201281）（英國 Abcam 公司）；TGF-β1 抗體（美國 Santa Cruz 公司，批號 sc-130348）；p38MAPK（批號 8690S）、p-p38MAPK 抗體（批號4511S）（美國 CST 公司）；HRP 標記山羊抗兔、山羊抗鼠抗體（上海碧云天生物技術有限公司）；大鼠 TGF-β1、IL-6 ELISA 試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）；硫酸吲哚酚對照品（美國Sigma 公司）。

1.3 儀器 515 型高效液相色譜儀、2475 型熒光檢測器、XBridge BEH C18色譜柱（美國 Waters 公司）；MS105DU 電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；ELX800 酶標儀（美國 BioTek 公司）；CKX31 倒置式生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；高電流電泳儀、蛋白濕轉印儀（美國 Bio-Rad 公司）；ZD-9950 脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；5810R 冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；7AN01446 純水儀（美國 Millipore 公司）。

2 方法

2.1 造模及給藥 通過SPSS22.0 軟件將大鼠隨機分為空白組、模型組、通腑泄濁法組、大黃配方顆粒組，其中空白組 6 只，其余 3 組各 8 只。采用Yokozawa 法建立慢性腎臟病大鼠模型，即每天上午灌胃給予2.5%腺嘌呤混懸液（200 mg／kg），第4 周周末每組隨機取2 只大鼠目內眥檢測 Scr、BUN 水平以評價造模情況，第5 周隔天灌胃給予2.5%腺嘌呤混懸液（200 mg／kg）以維持病程進展，至第7 周停止，在此期間空白組灌胃給予相應體積蒸餾水，同時各組大鼠下午給予相應藥物治療。根據人和動物等效劑量比值，按照成人給藥劑量計算給藥量，通腑通腑泄濁法組為大黃配方顆粒0.6 g／kg、牡蠣配方顆粒 0.045 g／kg、附子配方顆粒 0.15 g／kg、蒲公英配方顆粒 0.36 g／kg、槐米配方顆粒 0.54 g／kg、六月雪配方顆粒 0.09 g／kg，大黃配方顆粒組為0.6 g／kg，將上述配方顆粒溶于10 mL 蒸餾水中制成混懸液，按照 10 mL／kg 劑量每天灌胃給藥，空白組、模型組大鼠下午灌胃給予等體積蒸餾水。實驗過程中，模型組、通腑泄濁法組、大黃配方顆粒組均死亡2 只大鼠。

2.2 標本采集 第8 周實驗結束后大鼠禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉（0.2 mL／100 g），麻醉后腹主動脈取血，保存于促分離采血管中，靜置30 min 后，3 000 r／min 離心 10 min 取上清液送檢。采血結束后，摘取大鼠雙側腎臟，剔除腎周筋膜組織，生理鹽水清洗殘余血液，于腎門處縱行剖開腎臟，4%多聚甲醛固定24 h，制作病理切片，分別進行HE、Masson 染色；其余腎臟組織置于無菌凍存管中，放入液氮備用。

2.3 生化指標檢測 高效液相色譜-熒光分析法檢測硫酸吲哚酚（IS），ELISA 法檢測胱抑素C（CysC）、白介素-6（IL-6）、TGF-β1，委托南京中醫藥大學第三附屬醫院檢驗科檢測血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、同型半胱氨酸（HCY）、24 h 尿蛋白。

2.4 腎臟病理形態學變化 多聚甲醛固定的腎臟組織進行脫水、包埋、切片后，分別進行 HE、Masson 染色，觀察相關病理形態學變化。然后，Masson 染色選取圖片上藍色作為有效區域，每張切片隨機選取 6 個 200 倍視野，通過 Image-Pro Plus6.0 圖像分析系統對圖像進行半定量分析，計算膠原纖維占整體視野面積的比例，以此作為判斷腎臟纖維化程度的指標。

2.5 腎臟組織α-SMA、Col-I 蛋白表達檢測 采用免疫組化技術，將石蠟包埋的切片常規脫蠟，抗原熱修復后血清封閉，分別滴加α-SMA、Col-I 抗體孵育過夜，滴加二抗，顯微鏡下控制DAB 液顯色，蘇木素復染。然后，在200 倍視野下每張切片隨機挑選6 個拍照，以棕黃色作為判斷陽性的標準，通過Image-Pro Plus 6.0 軟件分析陽性區域累積光密度值（IOD）。

2.6 腎臟 TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK 蛋白表達檢測 采用Western blot 法。取100 mg 腎臟組織剪碎，加入含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的裂解液，組織勻漿后靜置 30 min 裂解，4 ℃ 下12 000 r／min離心 15 min，取上清液，按照 BCA 試劑盒說明書檢測蛋白濃度，然后按照相應比例與SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液統一配制成蛋白上樣品，煮沸10 min 使蛋白充分變性，根據說明書提示配制分離膠和濃縮膠，在泳道中加入蛋白樣品，置于盛有電泳液的電泳槽中進行電泳，電泳結束后取下凝膠，將凝膠中的蛋白轉移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫下孵育1 h，10%TBST 洗滌3 次，每次 10 min，分別加入稀釋后的一抗［TGF-β1（1 ∶500）、p38MAPK（1 ∶1 000）、p-p38MAPK（1 ∶1 000）、GAPDH（1 ∶10 000）］，4 ℃下孵育過夜，用 10%TBST 洗滌 3 次，每次 15 min，加入相應二抗［HRP 標記的山羊抗兔（1 ∶2 000）和 HRP 標記的山羊抗小鼠（1 ∶2 000）］，室溫下孵育 2 h，TBST 洗滌 5 次，每次約 12 min，取出 PVDF 膜，將顯影液均勻地涂抹于膜上，曝光定影。然后通過Image J 軟件檢測灰度值，用于蛋白表達半定量分析。

2.7 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，數據以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，并進行方差齊性檢驗，方差相齊時采用LSD法，方差不齊時采用 Dunnett’s T3 法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況 圖1顯示，與空白組比較，模型組大鼠出現多飲、多尿、體質量減輕、毛發干枯脫落、行動遲緩、精神萎靡等癥狀，其中體質量更顯著（P＜0.01）；與模型組比較，通腑泄濁法組大鼠體質量顯著升高（P＜0.05）。與空白組比較，模型組大鼠左腎與體質量比例顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，通腑泄濁法組其比例顯著下降（P＜0.01）。

3.2 生化指標 圖2顯示，與空白組比較，模型組 BUN、Scr、CysC、HCY、IS、24 h 尿蛋白、IL-6、TGF-β1顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，通腑泄濁法組上述指標顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 各組大鼠一般情況Fig.1 General conditions of rats in various groups

3.3 腎臟病理變化 圖3顯示，空白組大鼠腎臟形似蠶豆，色澤暗紅，光鏡下未見硬化腎小球；模型組大鼠腎臟體積增大，呈灰白色，表面粗糙，密布白色顆粒物，腺嘌呤代謝物結晶沉積于腎臟，大量炎癥細胞浸潤，腎小球結構紊亂，腎間質纖維化，腎小管囊性擴張，大量管腔閉塞，系膜增生明顯，符合腺嘌呤模型腎臟病理變化；通腑泄濁法組、大黃配方顆粒組大鼠腎臟病理變化較模型組明顯減輕。Masson 染色顯示，與空白組比較，模型組大鼠腎臟纖維化程度顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，通腑泄濁法組大鼠腎臟纖維化程度顯著下降（P＜0.05）。

3.4 α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達 圖4顯示，與空白組比較，模型組大鼠α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，通腑泄濁法組α-SMA 蛋白表達顯著降低（P＜0.01），Col-Ⅰ蛋白表達也有所降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠生化指標Fig.2 Biochemical indices of rats in various groups

圖3 各組大鼠腎臟病理變化Fig.3 Renal pathological changes of rats in various groups

3.5 TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK 蛋 白 表達 圖5顯示，與空白組比較，模型組 TGF-β1、pp38MAPK 蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，通腑泄濁法組兩者蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。

4 討論

慢性腎臟病臨床表現與中醫 “癃閉”“水腫”“腎勞”“溺毒”等病證相似，其病性為本虛標實，病機為脾腎虧虛，濁毒內蘊，素體稟賦不足、情志內傷、勞倦虛損等各種病因導致脾腎虧虛、濕濁蘊結、升降失司、濁毒內蘊而發病，內生濁毒之邪進而損傷腎元，累及腎絡，致使氣血運行不暢，瘀血內阻，腎失蒸騰氣化，開闔無度，濁毒排泄失司，蓄積體內，進一步加重腎臟損害，六腑以通為用，故施以通腑泄濁之法，使內蘊之濁毒從大腸排出體外，為防止濁毒再次蓄積，通腑泄濁法應結合辨證貫穿于整個治療。大黃作為通腑泄濁法的代表藥物，常用于治療慢性腎臟病，通腑泄濁方中該藥材通腑泄濁，活血化瘀，可使內蘊之濁毒排出體外，為君藥；生牡蠣收斂固澀，防大黃瀉下太過；熟附子益腎溫陽，扶助正氣，并防止苦寒瀉下之藥攻伐太過；蒲公英清熱解毒，散結消腫；生槐米涼血止血；六月雪清熱利濕、舒筋活絡，諸藥配伍，共奏通腑泄濁、淡滲利濕、活血化瘀、溫腎益氣之功效。前期研究顯示，泄濁方可降低腺嘌呤誘導的慢性腎臟病大鼠尿毒癥毒素水平，延緩腎臟間質纖維化進展［1］。

圖4 各組α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達Fig.4 α-SMA and Col-Ⅰ protein expressions in various groups

圖5 各組 TGF-β1、p-p38MAPK 蛋白表達Fig.5 TGF-β1 and p-p38MAPK protein expressions in various groups

研究表明，TGF-β1／p38MAPK 信號通路與腎臟炎癥及纖維化密切相關［2-3］，其中 p38MAPK 可通過調節 TGF-β1、核因子-κB（NF-κB）等表達來影響腎間質纖維化進展，是腎纖維化的一條經典途徑［4］，是 MAPK 家族中的細胞內信號轉導通路，激活后磷酸化的p38MAPK（p-p38MAPK）參與應激條件下細胞凋亡、免疫調節、細胞轉化和炎性反應［5］；TGF-β1 通過激活成纖維細胞，使細胞外基質（ECM）合成增加并抑制其分解，可誘導腎小管上皮細胞纖維化［6-7］，作為 p38MAPK 通路上游的啟動信號或下游的信號產物，它是信號轉導的關鍵，在通路上游通過激活p38MAPK 發揮其生物活性，而作為下游p38MAPK 信號通路的產物，TGF-β1 合成過多時可加劇腎小球硬化和腎間質纖維化，加速慢性腎臟病進展［8］，而 p38MAPK 活化又可加重 TGF-β1 介導的小鼠小球系膜細胞腎損傷［9］，誘導腎臟細胞凋亡［10］。前期報道，大黃酸可有效抑制TGF-β1 所致間質成纖維細胞增殖，并抑制其誘導的間質成纖維細胞表達α-SMA 和纖維連接蛋白（FN）合成［11］，同時還可通過干擾 p38MAPK 信號通路來抑制大鼠腎小管上皮細胞轉分化［12］。

本實驗發現，腺嘌呤所致腎臟纖維化與TGF-β1／p38MAPK 信號通路過度激活相關，而通腑泄濁方與大黃可抑制慢性腎臟病大鼠腎臟TGF-β1、p-p38MAPK 過度表達，延緩腎臟纖維化進展，可能是通過抑制 TGF-β1／p38MAPK 信號通路所致；通腑泄濁法組、大黃配方顆粒組大鼠腎臟α-SMA表達較模型組明顯降低，而Col-I 雖也有所下降但無明顯差異，表明該方法延緩腎臟纖維化的作用點可能與抑制早期腎臟纖維化相關，同時若膠原蛋白在腎臟大量沉積時，單純運用通腑泄濁法可能收效甚微，此時應結合患者病情予以補腎益氣、活血化瘀等法；通腑泄濁方、大黃均可降低血清IS，前者作用顯著更強，同時腸源性尿毒癥毒素IS 也參與誘導腎臟纖維化［13］，通腑泄濁法組腎臟纖維化程度低于大黃配方顆粒組也可能也與此相關，而且單味大黃治療可改善大鼠體質量，降低 BUN、CysC、24 h 尿蛋白，但對于降低單腎與體質量比例、Scr、HCY 仍顯不足，可能與樣本量偏小有關，也提示單味大黃雖然對慢性腎臟病具有療效，但仍有局限，而進行相應組方配伍后各項指標改善均較明確，其機制可能與組方后所具有的多途徑、多靶點治療作用相關，同時也提示臨床上單味藥治療病癥時需根據實際情況加以辨治，切勿讓中醫藥治療囿于機械。

通腑泄濁法治療慢性腎臟病的潛在機制并非單純瀉下排毒之功，仍宗去邪以安正之理，該方法不僅局限于祛邪排毒之效，更重要的在于其扶正護腎之力，潛在機制可能與以下幾點有關：（1）調節腸道菌群，參與腸源性毒素的代謝，降低患者血清中毒素含有量；（2）調節與免疫相關的炎癥因子IL-6、TGF-β1，從而減輕炎癥反應、腎臟損害，并改善微炎癥狀態；（3）抑制促纖維化因子、腎臟纖維化相關信號通路及蛋白表達，從而延緩腎臟纖維化；（4）降低尿蛋白排泄，減輕尿蛋白對腎小管的損傷，抑制補體激活及細胞凋亡，保護足細胞，從而保護腎臟。

綜上所述，通腑泄濁法可清除慢性腎臟病大鼠尿毒癥毒素，降低24 h 尿蛋白，減輕相關炎癥反應，并延緩腎臟纖維化進展，其機制可能與抑制TGF-β1／p38MAPK 信號通路有關。