HPLC法同時(shí)測(cè)定寶兒康散中9種成分

邢曉紅，張 靜，董 卓，姚韌輝，李春鋼?

（1.唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院兒科教研室，河北 唐山 063000；2.唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥劑教研室，河北 唐山 063000）

寶兒康散收載于衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十冊(cè)（標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)WS3-B-1966-95），由太子參、白術(shù)（炒）、茯苓、石菖蒲、芡實(shí)、北沙參、山藥、陳皮等14 味藥材加工而成，主要用于小兒脾胃虛弱、消化不良、食欲不振、大便異常、精神困倦、睡眠不安、夜驚、夜啼等病癥的治療［1］，對(duì)小兒急性腹瀉、小兒慢性遷延性腹瀉、小兒營(yíng)養(yǎng)性缺鐵性貧血、嬰幼兒非感染性腹瀉療效顯著，而且臨床應(yīng)用安全［2-7］。方中太子參、炒白術(shù)、山藥、北沙參補(bǔ)氣健脾、益氣養(yǎng)陰，為主藥，輔以茯苓、白扁豆、芡實(shí)健脾化濕，薏苡仁、陳皮和胃調(diào)中，石菖蒲、蓮子化濕和胃、開(kāi)胃進(jìn)食、安神定驚，山楂、麥芽消食健胃，炙甘草調(diào)和諸藥，諸藥共奏，以達(dá)補(bǔ)氣健脾、開(kāi)胃消食、滲濕、止瀉之功效［6］。

寶兒康散為中成藥復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)方中任何藥材進(jìn)行定量測(cè)定研究，僅檢索到對(duì)其中橙皮苷含有量進(jìn)行測(cè)定的報(bào)道［8-10］，但單一成分難以有效控制其質(zhì)量穩(wěn)定性和療效一致性。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定寶兒康散中太子參代表性成分太子參環(huán)肽B，白術(shù)代表性成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，茯苓代表性成分去氫土莫酸、土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸，石菖蒲代表性成分 β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚的含有量，以期為該制劑質(zhì)量控制方法的建立提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；AE240 型電子分析天平（十萬(wàn)分之一，瑞士 Mettler-Toledo 公司）；YQ-920A 型超聲波清洗器（上海易凈超聲波儀器有限公司）。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（111978-201501，含有量99.9%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（111975-201501，含有量 99.9%）、β-細(xì)辛醚（112018-201601，含有量96.8%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；太子參環(huán)肽B（145459-19-4，含有量98.0%）對(duì)照品購(gòu)自上海廣銳生物科技有限公司；去氫土莫酸（6754-16-1，含有量98.0%）、土莫酸（20126-76-5，含有量 98.0%）、去氫茯苓酸（77012-31-84，含有量 98.0%）對(duì)照品均購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；茯苓酸（6754-16-1，含有量98.0%）對(duì)照品購(gòu)自上海純優(yōu)生物科技有限公司；α-細(xì)辛醚（2883-98-9，含有量98.0%）對(duì)照品購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司。寶兒康散（每瓶裝 1 g，批號(hào) B170401、B170501、B180202）購(gòu)自廣東宏興集團(tuán)股份有限公司宏興制藥廠。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取太子參環(huán)肽B、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、去氫土莫酸、土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚對(duì)照品適量，甲醇分別制成 0.372、0.436、0.398、0.792、0.316、0.474、0.952、2.974、2.178 mg／mL 貯 備液，各精密量取 2.5 mL，置于 50 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液制備 取裝量差異項(xiàng)下散劑內(nèi)容物，研成細(xì)粉，過(guò)80 目篩后精密稱取2.0 g，置于25 mL 具塞錐形瓶中，加20 mL 甲醇超聲（400 W、40 kHz）提取 30 min，放冷，甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性樣品溶液 按照散劑處方和工藝，分別制備不含太子參、白術(shù)（炒）、茯苓、石菖蒲的陰性樣品，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.4 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.05% 磷酸，梯 度洗 脫（0～12.0 min，40% A；12.0～17.0 min，40%～52% A；17.0～24.0 min，52%～65% A；24.0～35.0 min，65%～87% A；35.0～44.0 min，87%～92% A；44.0～50.0 min，92%～40%A）；0～17.0 min 在 203 nm［11-12］波長(zhǎng)下檢測(cè)太子參環(huán)肽 B，17.0～24.0 min 在 220 nm［13-14］波長(zhǎng)下檢測(cè)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，24.0～35.0 min 在210 nm［15-16］波長(zhǎng)下檢測(cè)去氫土莫酸、土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸，35.0～50.0 min 在 257 nm［17］波長(zhǎng)下檢測(cè) β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚；體積流量0.9 mL／min；柱溫 35 ℃；進(jìn)樣量 10 μL。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在 “2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可知，各成分與相鄰峰之間均能達(dá)到有效分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按各成分色譜峰計(jì)，均不低于3 500。

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取 “2.1”項(xiàng)下貯備液 0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于 6 個(gè)20 mL 量瓶中，甲醇制成20 倍質(zhì)量濃度差的對(duì)照品溶液，在 “2.5”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.7 精密度試驗(yàn) 取 “2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在 “2.5”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得太子參環(huán)肽B、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、去氫土莫酸、土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚峰面積RSD 分別為1.21%、1.15%、1.06%、0.90% 、1.19% 、1.05%、0.82%、0.55%、0.62% ，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（批號(hào)B170401）散劑6 份，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備 6 份供試品溶液，在 “2.5”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得太子參環(huán)肽B、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、去氫土莫酸、土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚含有量RSD 分別為1.82%、1.70%、0.73%、1.59% 、1.74% 、0.63% 、1.45% 、1.03% 、0.87% ，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批（批號(hào)B170401）散劑，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫下 0、2、4、6、8、12 h 在 “2.5”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得太子參環(huán)肽B、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、去氫土莫酸、土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚峰面積 RSD 分別為1.15% 、1.09% 、1.10% 、0.86% 、1.17% 、1.08% 、0.85%、0.60%、0.96%，表明供試品溶液在 12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的散劑（批號(hào) B170401）6 份，研成細(xì)粉，過(guò) 80 目篩后每份精密稱取1.0 g，置于25 mL 具塞錐形瓶中，精密加入對(duì)照品溶液（太子參環(huán)肽B 0.199 mg／mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 0.257 mg／mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ0.213 mg／mL、去氫土莫酸 0.442 mg／mL、土莫酸 0.171 mg／mL、去氫茯苓酸 1.289 mg／mL、茯苓酸 0.531 mg／mL、β-細(xì)辛醚 2.174 mg／mL、α-細(xì)辛醚 1.441 mg／mL）各1.0 mL，再加入 11 mL 甲醇，超聲（400 W、40 kHz）提取 30 min，放冷，甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，在 “2.5”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，太子參環(huán)肽B、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、去氫土莫酸、土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚平均加樣回收率分別為 98.11%、99.18%、97.81%、99.85%、96.94% 、97.83% 、98.92% 、100.05%、99.26% ，RSD 分別為 1.01%、1.34%、0.81%、0.59%、1.25% 、0.91% 、1.29% 、0.68% 、1.10% 。

2.11 樣品含有量測(cè)定 取3 批散劑（B170401、B170501、B180202），按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.5”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，平行3 次，計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g， n=3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／g， n=3）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法篩選 本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇［11-18］、50% 甲醇、乙醇、50% 乙醇，發(fā)現(xiàn)以甲醇為提取溶劑時(shí)各成分綜合提取效率最佳，在此基礎(chǔ)上又比較了超聲提取［11-18］、回流提取，以及提取時(shí)間 15、30、60 min，最終確定甲醇超聲提取30 min作為供試品溶液制備方法。

3.2 流動(dòng)相篩選 本實(shí)驗(yàn)首先比較了乙腈-水［11-12］、甲醇-水［13-14］，發(fā)現(xiàn)以前者為流動(dòng)相時(shí)太子參環(huán)肽B、土莫酸、去氫茯苓酸分離效果更理想，但去氫土莫酸、β-細(xì)辛醚、茯苓酸分離效果不佳，并存在拖尾現(xiàn)象。然后，又考察了乙腈-0.05% 磷 酸［15-16］、乙 腈-0.1% 甲 酸［17-18］、乙 腈-0.1%冰醋酸，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.05%磷酸為流動(dòng)相時(shí)分離效果更理想，在此基礎(chǔ)上對(duì)其洗脫比例進(jìn)行不斷摸索，最終確定 “2.4”項(xiàng)下色譜條件，此時(shí)色譜峰基線平穩(wěn)，峰形對(duì)稱，各成分均能達(dá)到有效分離。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定寶兒康散中太子參環(huán)肽B、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、去氫土莫酸、土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚的含有量，發(fā)現(xiàn)各成分在較短時(shí)間內(nèi)均可被完全分離并準(zhǔn)確檢測(cè)，而且該方法精密、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，重復(fù)性好，可為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高和完善提供數(shù)據(jù)支持。