MIP-3α-SA雙功能融合蛋白的制備及其生物學(xué)功能鑒定

宋志純，戴數(shù)，王朋，高基民

（1.麗水市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 麗水 323000；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康，我國每年新發(fā)腫瘤病例達(dá)430余萬例，死亡280多萬例[1]，腫瘤疫苗可誘發(fā)自身特異性免疫應(yīng)答，抑制并清除腫瘤[2]，因特異性高、針對(duì)性強(qiáng)、不良反應(yīng)小、安全穩(wěn)定，已經(jīng)成為惡性腫瘤治療的重要方法。通過基因修飾、細(xì)胞表面錨定修飾將細(xì)胞因子修飾到腫瘤細(xì)胞是腫瘤疫苗新的發(fā)展方向[3]。

巨噬細(xì)胞炎性蛋白3α（macrophage inflammatory protein-3α，MIP-3α）又稱CCL20，可參與樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞的定向遷移，在腫瘤免疫方面發(fā)揮作用[4]。它的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞能誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞免疫，抑制腫瘤生長、延長荷瘤小鼠的生存期[5]。另外，瘤內(nèi)直接注射MIP-3α可使DC和CD8+T細(xì)胞浸潤到腫瘤實(shí)質(zhì)內(nèi)，抑制腫瘤生長的作用顯著[6]。鏈親和素（streptavidin，SA）是由鏈霉菌分泌的四聚體蛋白，能與生物素快速緊密不可逆結(jié)合，其結(jié)合力比抗原抗體間的親和力高1萬倍，可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的諸多領(lǐng)域[7]。

利用腫瘤細(xì)胞表面極易生物素化及SA能與生物素高效而超強(qiáng)結(jié)合的特性[8]，我們制備了SA標(biāo)記的MIP-3α融合蛋白，使其錨定在已生物素化的腫瘤細(xì)胞表面，并產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫作用。基于人與鼠的氨基酸同源性為73%，而該腫瘤細(xì)胞疫苗的抗腫瘤效應(yīng)需要在小鼠體內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，為此我們構(gòu)建了MIP-3α-SA-PET21重組表達(dá)載體，并在大腸桿菌內(nèi)高效誘導(dǎo)表達(dá)獲得融合蛋白，經(jīng)純化、復(fù)性后對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了研究。該研究為MIP-3α表面錨定修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為后續(xù)的臨床實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞：E.coliRosetta（DE3）、DH5α購自北京Novagen公司，MIP-3α-SA-PET21質(zhì)粒及RM-1細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑：IPTG及氨芐霉素、青鏈霉素、氯霉素購自美國Sigma公司，Sulfo-NHS-L C-Biotn購自美國Pierce公司，Ni-NTA螯合層析填料購自德國Qiagen公司，Transwell趨化小室購自美國Corning公司，抗-HIS單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG、FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG、DAB顯色試劑盒、硝酸纖維素膜均購自上海碧云天公司，胎牛血清及RPMI1640培養(yǎng)基購自杭州四季青生物工程材料有限公司，MIP-3α購自德國Bender公司，BSA購自瑞典Maverick公司，蛋白質(zhì)預(yù)染marker購自加拿大Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 MIP-3α-SA融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：感受態(tài)細(xì)胞制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化按常規(guī)CaC12法，將MIP-3α-SAPET21質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐青霉素（終濃度50 mg/L）的平皿篩選轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌。隨機(jī)挑選單克隆菌落，37 ℃于含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待OD600值=0.4～0.6時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)，摸索最佳誘導(dǎo)濃度及時(shí)間，用12% SDS-PAGE篩選表達(dá)情況。

1.2.2 包涵體的提取：分別用以下2種方法破碎包涵體并比較其效果：①菌體按1:20（w/v）重懸于超聲緩沖液（50 mmol/L Tris-HC1、1 mmol/L EDTA、10 mmol/L NaCl）中，冰浴并超聲破菌，收集包涵體；②菌體按1:20（w/v）重懸于PBS緩沖液（200 mg/mL溶菌酶）中，冰浴并高壓破菌，收集包涵體。用專用洗滌液（專利號(hào)CN1169998A）洗滌，離心棄去上清，收集包涵體。

1.2.3 MIP-3α-SA融合蛋白的純化：鎳柱親和層析純化：包涵體用溶解液（20 mmol/L Tris-HC1，8 mol/L尿素，5 mmol/L β-ME）溶解，離心棄去沉淀，過濾除菌后將上清液上樣于Ni-NTA柱，鎳柱用平衡液（20 mmol/L Tris-HC1，6 mol/L尿素，5 mmol/L β-ME，500 mmol/L NaC1）先平衡，上清用平衡液稀釋2倍上柱，然后依次用含50、75及150 mmol/L咪唑的平衡液洗脫，收集不同咪唑濃度洗脫峰，用12% SDS-PAG分析蛋白純化情況。

1.2.4 MIP-3α-SA融合蛋白的復(fù)性：將純化后的蛋白調(diào)整濃度至0.1～0.2 g/L，在透析液（20 mmol/L Tris-HC1，4 mol/L尿素，50 mmol/L NaC1，1 mmol/L GSH，0.2 mmol/L GSSG，50 mL/L甘油，0.5 mmol/L EDTA）中4 ℃透析復(fù)性12 h，依次降低透析液濃度，最后在PBS中繼續(xù)透析復(fù)性12 h。離心除去不溶物，上清經(jīng)過濾除菌，分裝于-70 ℃保存。10% SDSPAGE分析蛋白復(fù)性情況。

1.2.5 Western blot分析：用12% SDS-PAGE電泳分離復(fù)性后蛋白，半干電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用50 mL/L的脫脂奶粉于室溫下封閉1.5 h，加入抗-HIS單克隆抗體（mAb 1:1 000稀釋）4 ℃過夜，TBST洗滌，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗（1:1 000稀釋），37 ℃孵育1 h，DAB顯色液觀察結(jié)果。

1.2.6 銀氨染色：用12% SDS-PAGE電泳分離復(fù)性后蛋白，將整塊PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至50%甲醛及10%醋酸混合液中浸泡1 h，脫色漂洗，用銀氨染色液（0.8 g 硝酸銀溶于4 mL蒸餾水中逐滴加入0.36% NaOH 21 mL于14.8 mmol/L氨水中）染色并洗滌液（0.5 mL 1%檸檬酸和50 μL 38%甲醛混合，加水至100 mL）中洗滌，待顯色后用1%醋酸終止反應(yīng)并觀察結(jié)果。

1.2.7 MIP-3α-SA融合蛋白的趨化活性測(cè)定：①人淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備：淋巴細(xì)胞分離液分離人血淋巴細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106/mL重懸于無血清的1640培養(yǎng)基中備用；②MIP-3α-SA的準(zhǔn)備：將-70 ℃保存的MIP-3α-SA用PBS分別稀釋為不同濃度（1 000 ng/mL、 100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、0.1 ng/mL），PBS為空白對(duì)照；③加入MIP-3α-SA：將稀釋好后37 ℃預(yù)溫的MIP-3α-SA樣品加入Costar 3422微孔趨化板的下槽中，每個(gè)濃度MIP-3α-SA加3個(gè)復(fù)孔，每孔 600 μL，裝上上槽小室，MIP-3α做陽性對(duì)照；④加入人淋巴細(xì)胞：將稀釋好的人淋巴細(xì)胞懸液加入上槽小孔中，每孔100 μL；⑤孵育：將趨化小室放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，孵育3～4 h；⑥計(jì)數(shù)：將趨化小室下層細(xì)胞充分混勻，計(jì)數(shù)各孔細(xì)胞數(shù)并計(jì)算趨化指數(shù)（chemo tactic index，CI：是指細(xì)胞遷移到待測(cè)樣品液的數(shù)目和遷移到空白對(duì)照液的數(shù)目的比值）。CI=實(shí)驗(yàn)組趨化的細(xì)胞數(shù)/陰性對(duì)照組趨化的細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 MIP-3α-SA融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞表面錨定修飾效率的檢測(cè)：取生長狀態(tài)良好的RM-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×109/L，加入Sulfo-NHS-LC-Biotin使終濃度為1 g/L，37 ℃，30 min；PBS洗滌，加入MIP- 3α-SA，37 ℃，60 min；PBS洗滌，加入抗MIP-3α抗體，37 ℃，30 min；PBS洗滌，加入FITC標(biāo)記的二抗，37 ℃，避光30 min；500 μL PBS重懸，流式細(xì)胞儀分析MIP-3α-SA融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的錨定修飾效率。

2 結(jié)果

2.1 MIP-3α-SA融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將MIP-3α-SAPET21重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta（DE3）中，經(jīng)IPTG篩選后獲得工程菌，經(jīng)12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)證實(shí)在相對(duì)分子質(zhì)量31 kDa處有蛋白帶，與預(yù)測(cè)的目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量相符。而未經(jīng)誘導(dǎo)的工程菌在同一位置未見蛋白帶。BandScan軟件分析得出目的蛋白約占總蛋白的30%。表達(dá)菌破碎后（見圖1），分析上清或包涵體表達(dá)：證明目的蛋白主要以包涵體形式存在。分析不同濃度IPTG（見圖2A）和相同濃度IPTG不同時(shí)間（見圖2B）的誘導(dǎo)表達(dá)情況：證明IPTG終濃度0.3 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間5 h為最佳。

圖1 12% SDS-PAGE鑒定MIP-3α-SA融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

圖2 12% SDS-PAGE鑒定MIP-3α-SA融合蛋白的表達(dá)情況

2.2 包涵體的提取及MIP-3α-SA融合蛋白的純化 比較2種方法進(jìn)行包涵體的提取，鎳柱親和層析，12% SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示：加入溶菌酶后，掛柱效果佳（見圖3A-B），包涵體洗滌后經(jīng)過鎳柱親和層析，雜蛋白主要被穿透和50 mmol/L咪唑洗脫出，從峰值圖（見圖4）上可以看到目的蛋白在75 mmol/L咪唑濃度下被洗脫，且純度和濃度最高，其中純度達(dá)到95%以上（見圖5A-B）。

圖3 12% SDS-PAGE鑒定MIP-3α-SA融合蛋白純化情況

圖4 MIP-3α-SA融合蛋白鎳柱親和層析AKTA峰值圖

2.3 MIP-3α-SA融合蛋白的復(fù)性 采用尿素梯度透析復(fù)性，復(fù)性后非還原狀態(tài)的融合蛋白主要以多聚體的形式存在（見圖6A-B）。

2.4 MIP-3α-SA融合蛋白的Western blot分析和銀氨染色 Western blot結(jié)果證實(shí)，MIP-3α-SA融合蛋白純化后，復(fù)性后蛋白質(zhì)單體與多聚體均可與抗-HIS抗體結(jié)合，并顯色（見圖7A）；銀氨染色結(jié)果證實(shí)，第一泳道m(xù)arker條帶經(jīng)銀離子染色后顯示出多條雜帶，而目的蛋白復(fù)性后經(jīng)染色顯示為單一條帶（見圖7B）。

2.5 趨化活性測(cè)定 利用人淋巴細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同濃度的MIP-3α-SA有趨化人血淋巴細(xì)胞的活性且成劑量依賴效應(yīng)，其中100 ng/mL趨化活性最高，之后提高M(jìn)IP-3α-SA融合蛋白濃度趨化活性反而減低（見表1和圖8）。

圖5 12% SDS-PAGE電泳鑒定MIP-3α-SA融合蛋白鎳柱親和層析純化圖

圖6 SDS-PAGE電泳鑒定MIP-3α-SA融合蛋白復(fù)性圖

圖7 MIP-3α-SA融合蛋白的Western blot分析（A）和銀氨染色（B）

2.6 FCM分析 用MIP-3α的抗體及熒光標(biāo)記的二抗，經(jīng)FCM對(duì)錨定在已生物素化的RM-1腫瘤細(xì)胞表面的MIP-3α-SA融合蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：MIP-3α-SA融合蛋白能高效錨定修飾表面已生物素化的RM-1腫瘤細(xì)胞，修飾效率為99.7%（見圖9）。左圖峰為未修飾的細(xì)胞（陰性對(duì)照），而右峰為MIP-3α-SA融合蛋白錨定修飾的細(xì)胞。

3 討論

目前CCL20 應(yīng)用于腫瘤治療的常用研究方法有：①單一趨化因子的療法：將趨化因子導(dǎo)入腫瘤環(huán)境中在體內(nèi)可招募相關(guān)的白細(xì)胞亞群，減少惡性細(xì)胞的腫瘤形成，目前我們課題組正在致力于應(yīng)用鏈親和素標(biāo)記的CCL20治療前列腺癌及膀胱癌等的研究，CCL20可以較強(qiáng)地趨化未成熟的DC細(xì)胞，將CCL20腺病毒注射入不同的腫瘤模型（B16黑色毒瘤細(xì)胞，Lewis肺細(xì)胞癌等）較明顯地抑制了腫瘤的生長并增加了腫瘤宿主特異性存活。CCL20腺病毒注射可刺激局部CD8+細(xì)胞明顯聚集，激活細(xì)胞毒T細(xì)胞，進(jìn)而抵抗腫瘤細(xì)胞[5]，其具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。②共同應(yīng)用2種趨化因子或細(xì)胞因子與趨化因子結(jié)合治療的療法：目前國外有文獻(xiàn)報(bào)道，聯(lián)合應(yīng)用CCL3和CCL20對(duì)小鼠胃癌有積極的治療作用[9]；另外CXCL9與IL-12聯(lián)合應(yīng)用也取得明顯的抑瘤效果，將趨化因子與活化的細(xì)胞因子聯(lián)合用于腫瘤微環(huán)境中，可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗腫瘤反應(yīng)并能明顯地減少系統(tǒng)地使用細(xì)胞因子所致的劑量限制性毒性作用；而我們課題組已經(jīng)研究出鏈親和素標(biāo)記的sCD40L[10]、TNFα[11]、白介素系列[12-14]蛋白對(duì)不同腫瘤的治療作用，而CCL20與其中兩兩聯(lián)合還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，且其相應(yīng)的機(jī)制還有待研究。③趨化因子與腫瘤相關(guān)抗原（TSA）相融合：我們研究的CCL20是否也有與相應(yīng)的白介素甚至GM-CSF結(jié)合發(fā)揮抗腫瘤作用，有待進(jìn)一步的探討。④腫瘤疫苗：將趨化因子導(dǎo)入腫瘤環(huán)境中在體內(nèi)可招募相關(guān)的白細(xì)胞亞群，減少惡性細(xì)胞的腫瘤形成，將趨化因子與其他免疫刺激細(xì)胞因子結(jié)合可提供較強(qiáng)的長期抗腫瘤免疫。因此，趨化因子也許作為潛在的天然佐劑而應(yīng)用于試驗(yàn)性抗腫瘤免疫治療即腫瘤疫苗。然而，目前國內(nèi)外尚無CCL20與細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤的相關(guān)報(bào)道，因而CCL20聯(lián)合其他細(xì)胞因子治療腫瘤的應(yīng)用前景尚有待進(jìn)一步研究。⑤CCL20聯(lián)合放射治療：應(yīng)用于腫瘤治療放射治療一直是惡性腫瘤的主要治療方法之一，但是無論治療的條件如何優(yōu)化，其療效始終難有突破性的提高。目前將CCL20基因串聯(lián)到早期生長反應(yīng)啟動(dòng)子（Egr21）下游，構(gòu)建Egr21啟動(dòng)的CCL20真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染Lewis肺癌細(xì)胞，通過放射誘導(dǎo)使腫瘤細(xì)胞中CCL20表達(dá)增強(qiáng)，有效趨化樹突狀細(xì)胞及淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤治療效應(yīng)，是對(duì)放射-基因治療新的嘗試[15-16]。

表1 MIP-3α-SA雙功能融合蛋白趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖8 MIP-3α-SA雙功能融合蛋白淋巴細(xì)胞趨化效率

圖9 FCM分析MIP-3α-SA融合蛋白對(duì)已生物素化的RM-1腫瘤細(xì)胞錨定圖

本研究基于本實(shí)驗(yàn)室建立的細(xì)胞膜表面錨定修飾技術(shù)平臺(tái)，利用該平臺(tái)制備了一系列鏈親和素連接的多種具有免疫佐劑作用的免疫刺激因子制備雙功能融合蛋白[10-14]，發(fā)揮其生物學(xué)活性，并誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性主動(dòng)免疫，已取得了良好成效。并且部分蛋白已建立了中試制備工藝，該平臺(tái)具有簡(jiǎn)便快捷、高效，對(duì)細(xì)胞、組織，機(jī)體無明顯的毒副作用等特點(diǎn)。本研究利用人淋巴細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同濃度的MIP-3α-SA有趨化人血淋巴細(xì)胞的活性且成劑量依賴效應(yīng)，其中100 ng/mL趨化活性最高，之后提高M(jìn)IP-3α-SA融合蛋白濃度趨化活性反而減低，猜測(cè)不同劑量的MIP-3α-SA對(duì)腫瘤的作用不同；有研究報(bào)道MIP-3α的表達(dá)可能參與了肺癌的侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，可能的機(jī)制為：MIP-3α與其受體CCR6結(jié)合后，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的重新分布，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞遷移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[17]。因而不同劑量的MIP-3α對(duì)腫瘤的促進(jìn)還是抑制作用還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，而探索合適的藥物劑量是今后研究的趨勢(shì)。

目前，我們已研發(fā)出部分SA標(biāo)記的可用于錨定修飾的膀胱癌及前列腺癌治療性疫苗。研究證明：SA標(biāo)記的細(xì)胞因子雙功能融合蛋白錨定修飾的表淺膀胱癌瘤苗可誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生有效的抗腫瘤作用，并且能有效防治表淺膀胱癌的復(fù)發(fā)[18-21]。

利用基因重組技術(shù)，我們構(gòu)建了MIP-3α-SAPET21重組表達(dá)質(zhì)粒，在C端設(shè)計(jì)了6×His標(biāo)簽使后期更利于鎳親和層析制備高純度的雙功能融合蛋白；SA和MIP-3α之間靠甘氨酸和絲氨酸的15肽連接，使各單元蛋白質(zhì)分子獨(dú)立折疊，保留各自生物學(xué)活性。我們制備的融合蛋白能夠在大腸桿菌中高效表達(dá)，純化后通過尿素梯度透析復(fù)性，經(jīng)人淋巴細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了MIP-3α-SA融合蛋白有MIP-3α介導(dǎo)的對(duì)人淋巴細(xì)胞的趨化作用且呈劑量依附性，以及SA介導(dǎo)的高效結(jié)合至表面已生物素化的小鼠前列腺癌RM-1細(xì)胞的功能（表面錨定修飾效率大于95%），以上研究為今后腫瘤防治以及新型腫瘤疫苗研制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。