羊蹄甲和穿山甲炮制品比較鑒別

沈多榮, 王慧芳, 吳芝園, 沈 敏, 談如藍, 劉 遜*

(1.南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院，江蘇 蘇州 215009；2.蘇州衛生職業技術學院，江蘇 蘇州 215009)

穿山甲，又名山甲片、甲片，為鯪鯉科動物穿山甲(Manis pentadactyla)的鱗甲，為國家二級重點保護野生動物，具有通經下乳，消腫排膿，搜風通絡等功效。穿山甲鱗片由特殊的高酪氨酸β-角蛋白(KAP)構成，含有膽固醇、二十三酸丁胺、脂肪族酰胺以及蛋白、D-絲-L-酪環二肽、L-絲-L-酪環二肽等主要成分。課題組前期研究發現穿山甲經砂炒炮制后，脂溶性成分無顯著變化、而蛋白成分顯著減少，環二肽顯著增加[1]。而且穿山甲炮制品的標志性成分D-絲-L-酪氨酸環二肽、L-絲-L-酪氨酸環二肽、L-甘-L-酪氨酸環二肽的含量變化與炮制條件存在相關性[2-3]。

羊蹄甲，為羊的蹄甲殼，民間有羊蹄甲代穿山甲的用藥習慣[4]，市場上也有使用羊蹄甲炮制品冒充穿山甲的現象。目前有關于中藥材鑒別的常見方法有通過性狀，氨基酸組成分析，凝膠電泳分析、薄層層析等[5-7]。但羊蹄甲的鑒定研究過去主要集中于原藥材，對于羊蹄甲炮制品的鑒別則未見報道，為了探討羊蹄甲與穿山甲炮制品在形態與成分方面的異同，本研究擬通過性狀、TLC、HPLC鑒定研究羊蹄甲與穿山甲炮制品在性狀與成分的異同，建立鑒定羊蹄甲與穿山甲炮制品的方法，以去偽存真。

1 材料與方法

1.1 供試材料

D-絲-L-酪氨酸環二肽、L-絲-L-酪氨酸環二肽、L-甘-L-酪氨酸環二肽對照品為課題組自制，通過1H-NMR、13C-NMR等方法確證其結構，HPLC法檢測純度>99%；甲醇，磷酸，三乙胺(色譜純，Fisher公司)。

TLC Scanner4 System薄層系統(瑞士CAMAG公司)；DGLC-3600 UltiMate? 3000高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技公司)；本實驗所用材料來源于蘇州衛生職業技術學院館藏標本。樣品均由作者通過性狀結合Cytb序列鑒定[8]。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品加工 羊蹄甲和穿山甲的炮制品為藥材經砂燙加工而成，具體操作方法：分別取羊蹄甲和穿山甲，按照2015版藥典附錄Ⅱ D的燙法進行炮制，用砂燙至羊蹄甲和穿山甲全體膨脹呈卷曲狀，呈黃色，質酥脆，臨用前搗碎成粉末。

1.2.2 性狀鑒定方法 從整體及粉末的大小、形態、色澤等方面[9]，對羊蹄甲及穿山甲炮制品進行性狀鑒定。

1.2.3 TLC鑒別方法 取羊蹄甲炮制品和穿山甲炮制品，粉碎成粗粉(過60目)。按藥典穿山甲鑒別項下規定分別取羊蹄甲和穿山甲炮制品粗粉1 g置于不同燒瓶中，各加50 mL的二氯甲烷，加熱回流提取1 h，放冷后過濾，取濾液進行蒸干，殘渣加1 mL二氯甲烷復溶，即得供試品溶液。用毛細管分別吸取羊蹄甲炮制品溶液和穿山甲炮制品溶液10 μL，點于同一硅膠G薄層板上。分別采用3種展開系統進行展開，取出后晾干，噴適量的10%硫酸乙醇溶液顯色，在105 ℃加熱數分鐘，置紫外光燈(365 nm)下檢視。

1.2.4 HPLC檢測方法

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱Hypersil ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫：30 ℃，流速：0.5 mL/min，流動相：甲醇-0.5%磷酸(15∶85)，檢測波長：210 nm，進樣量10 μL[10-11]。

1.2.4.2 供試品溶液 精密稱取羊蹄甲炮制品和穿山甲炮制品的粉末(過6號篩)各1 g，分別置于不同的錐形瓶中，加15 mL水稱重后，超聲提取30 min。放冷至室溫，稱重后用水溶液補足減失的量并搖勻，進行過濾處理。取續濾液，用0.22 μm水系微孔濾膜濾過，即得到供試品溶液。在上述色譜條件下檢測分析，得到羊蹄甲炮制品和穿山甲炮制品的HPLC色譜圖。

精密稱取對照品D-絲-L-酪氨酸環二肽、L-絲-L-酪氨酸環二肽、L-甘-L-酪氨酸環二肽適量，用流動相溶解，配制得到質量濃度分別為 0.1 mg/mL的混合對照品溶液。在上述色譜條件下檢測分析，得到對照品色譜圖。

2 結果與分析

2.1 性狀鑒定

羊蹄甲炮制品全體膨脹成鞋頭狀，外表面呈淡黃色至黃棕色，蹄壁厚薄不一，內中空呈船狀，蹄底部有的呈三角形，質酥脆，易碎(圖1)。穿山甲炮制品全體膨脹成扁片狀或卷曲成不規則狀，外表面呈淡黃色至黃棕色，寬端有數十條排列整齊的縱紋及數條橫線紋，內表面中部有一條明顯突起的弓形橫向棱線(圖1)。表明炮制品在外觀性狀方面存在顯著差異，但兩者粉末按藥典穿山甲鑒別項下進行鑒別則無顯著區別。

圖1 羊蹄甲炮制品和穿山甲炮制的外觀性狀圖

2.2 TLC鑒別

羊蹄甲炮制品與穿山甲炮制品在TLC色譜相同的位置上，主要斑點分別顯相同顏色熒光斑點，表明兩者在TLC方面無法區別(圖2)。

圖2 TLC色譜圖

2.3 HPLC檢測

HPLC結果表明：羊蹄甲炮制品溶液中沒有檢測到穿山甲標志性成分D-絲-L-酪氨酸環二肽、L-絲-L-酪氨酸環二肽、L-甘-L-酪氨酸環二肽，而穿山甲炮制品具有這三種的標志性成分。表明HPLC可以區分羊蹄甲與穿山甲炮制品(圖3)。

圖3 HPLC色圖譜

3 結論與討論

穿山甲由于環境破壞及人為盜獵，其資源日漸瀕危，價格也越來越高昂，不法分子為了謀求暴利，市場上存在著大量的以假亂真、摻假混淆等現象如用羊蹄甲炮制品冒用穿山甲，穿山甲、羊蹄甲炮制品兩者整體性狀存在差異，但是穿山甲臨床調劑時需打碎入藥，對于粉末狀的穿山甲、羊蹄甲炮制品，藥典穿山甲鑒別項下的粉末觀察方法由于穿山甲粉末缺乏特征鑒別點，兩者難以進行真偽識別。

為了區分兩者的粉末，本研究用苯-丙酮(20∶1)、三氯甲烷-乙酸乙酯(19∶1)、正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(7∶2∶0.5)3種TLC展開系統對穿山甲和羊蹄甲進行鑒別。由于羊蹄甲、穿山甲均來源于哺乳動物的角蛋白，兩者脂溶性成分相近，導致薄層色譜中的主要斑點顏色及Rf值相近，說明藥典項下的穿山甲薄層鑒別方法缺乏專屬性，無法對羊蹄甲類藥材做出鑒別。

而穿山甲與羊蹄甲炮制品水提液的HPLC圖譜有顯著差異，本法分辨力強，重現性好，可以快速、有效地鑒定穿山甲與羊蹄甲炮制品的藥材與粉末，這可能是由于穿山甲中酪氨酸含量較高，炮制后產生的小肽以酪氨酸環二肽同系物為主；這保證了穿山甲炮制品的質量，可為也保障人民群眾用藥安全提供有效依據。