石豆蘭無菌材料的建立及離體培養初探

黃崇成， 苗永美， 方 達， 王宇豪， 童 元

(安徽科技學院 生命與健康科學學院，安徽 鳳陽 233100)

石豆蘭屬(Bublophyllum) 植物全世界約有1 000種，主要分布于亞洲、非洲和美洲熱帶地區。我國有98種3變種，主要產于長江流域及其以南各省區，尤以云南南部為多。該屬植物具根狀莖和假鱗莖，假鱗莖密生或疏生于根狀莖上，卵圓至圓筒狀，葉生于假鱗莖頂端。有些種的株型優美，花色幽雅、果實玲瓏可愛，具有一定的觀賞價值；有些具藥用價值，常作民間用藥的有15種，全草或假鱗莖皆可入藥[1]，具清熱、滋陰、消腫、抗癌、抗焦慮等功效[2,3]。蘭科植物價值高，野生資源受到保護，怎樣通過組織培養加快繁殖力度為人工栽培提供大量組培苗，或者通過細胞培養提取藥用成分都是很重要的研究課題[3]。

植物生活在自然界中其表面會帶有各樣微生物，甚至其組織內也生有大量菌，尤其蘭科植物特殊生境、生長緩慢、具藥用功能等特點都會使得植物內外菌物較為豐富，這給無菌材料建立帶來巨大困難。在開展石豆蘭離體繁殖體系建立時發現石豆蘭橫走莖、假鱗莖表面菌較多，內生菌也極為豐富[4]。因此，本試驗開展內外菌物消毒處理方法研究及探索激素濃度，建立起離體繁殖體系并獲取大量無菌材料，為下一步原球莖誘導、增殖、懸浮培養、誘變等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

所用石豆蘭(Bulbophyllumsp.)材料采自福建南屏鴛鴦獼猴自然保護區。制霉菌素和萘啶酮酸用乙醚滅菌處理，紗布封口，揮干后，加入無菌水配成50 mg/mL的懸液。

1.2 方法

1.2.1 外植體外生菌的處理 取橫走莖最前端新生出的小嫩芽和假鱗莖兩種外植體，清水沖洗表面，加入0.1% HgCl2后分成兩組，一組做超聲(40 kHz，下同)處理，另一組不做超聲處理，處理5、10、15、20 min，共8個處理，無菌水漂洗5次，吸干。芽切除少許基部，假鱗莖約切成0.5 cm3的小塊，接種到M1：MS+6-BA 0.25 mg/L+NAA 0.05 mg/L的培養基上，每處理接種10瓶，每瓶3個芽和3個切塊。7 d統計污染和成活情況，污染率=污染外植體數/總外植體數×100%，成活率=成活外植體數/總外植體數×100%。

1.2.2 外植體內生菌的處理 1.2.1試驗結果表明假鱗莖在M1培養基上死亡率高，難以再分化出器官。因此，后面試驗只選用小嫩芽做培養材料，表面消毒處理后接種于添加制菌霉素和萘啶酮酸的M1培養基中，添加濃度見表2。每處理10瓶，每瓶6個材料，每個月轉接1次，培養90 d后計算污染率和成活率。

1.2.3 不同激素配比對外植體的生長的影響 取未污染的小嫩芽接種于M1培養基上，此時逐漸降低培養基中抗菌素濃度，經過長時間多次繼代后，基部逐漸長出粗壯的根，嫩芽生長，基部變粗形成橢圓形即假鱗莖，上面著生二葉，根莖處分化出小芽。為了探討激素配比對芽分化的影響，根據前期實驗，選用6-BA和NAA兩種激素，采用正交設計，具體表3。將單鱗芽帶根切下選取大小差不多一致的帶根鱗芽作為接種單元，每處理5瓶，每瓶4個鱗莖，60 d后統計新長出的芽，按培養后芽數/接種時芽數計算增殖倍數。

以上培養基中需添加0.5 g/L 活性炭、100 g/L土豆汁、3 0 g/L蔗糖、6 g/L瓊脂粉，pH=6.5。光照時間為12 h/d，光照強度為40 μmol /(m2·s)，溫度25±2 ℃。

2 結果與分析

2.1 不同消毒方式的消毒效果比較

表1 不同處理方式對外植體的殺菌效果

由表1可知，假鱗莖的污染率高，說明假鱗莖內外菌較多，而成活率比芽低，大部分逐漸發黃發白死亡，未死亡的只是維持綠色未見分化說明假鱗莖分化要求較高。單獨使用HgCl2消毒時，2種外植體的污染率都隨處理時間的延長逐漸降低，而成活率先升高后降低，有一些材料雖未出現污染，但長時間的HgCl2處理會對2種外植體造成傷害從而導致成活率下降；當然也有些材料出現輕微的污染但仍然存活。根據污染率和成活率綜合來看，在單獨使用HgCl2時，處理時間10 min效果最好。

HgCl2結合超聲處理比單獨使用HgCl2會降低污染率，芽污染率降低幅度在10%～20%之間，假鱗莖污染率降低幅度在13.33%～26.67%之間；只有超聲5～10 min處理能提高2種外植體的成活率，長時間超聲會降低成活率，可能因長時間超聲處理會對植物造成傷害。由此看出，HgCl2結合超聲處理能降低污染率，提高成活率，處理10 min時效果最好，芽和假鱗莖的污染率都降低了20%，成活率分別提高了10%和3.33%。

2.2 不同抗生素組合對石豆蘭內生菌的抑制效果比較

表2 不同抗生素組合對內生菌的抑制效果比較

藥用植物往往含內生菌，采取HgCl2結合超聲處理對表面菌起到較好的殺傷作用，而對內部菌殺傷力較弱，本研究發現隨著長時間繼代培養，材料切口處逐步長出多種菌物，生長緩慢，符合內生菌的生長特征，建立無菌材料時針對內生菌采取的做法是加入抗生素。由表2可知，僅采取HgCl2結合超聲處理在短時間內呈現較低的污染率，90 d后內生菌逐漸長出，污染率達83.33%；當培養基中加入制菌霉素和萘啶酮酸后，污染率降低。根據污染率和成活率兩個指標綜合考慮，確定最佳抗菌素組合為7號處理即制菌霉素75 mg/L和萘啶酮酸50 mg/L抑制效果最好，90 d時污染率為20.00%，無菌材料成活率為60%，芽出現了萌發和明顯的生長。

2.3 不同激素濃度和配比對鱗芽增殖的影響

表3 不同激素濃度和配比對鱗芽增殖的影響

表4 增殖培養中因素多重比較

注：同列數值間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著。

圖1 石豆蘭增殖

從圖1看出，芽主要從鱗芽基部長出并逐步生長，有些從鱗芽頂部分化出，分化情況受激素調控。多重比較結果(表4)說明6-BA和NAA對于石豆蘭鱗芽的增殖影響顯著，增殖倍數隨著6-BA濃度升高先增大后降低，2水平即0.4 mg/L時最大，顯著高于其它兩個水平；隨NAA濃度的增加，增殖倍數逐漸增大，3水平即0.2 mg/L時最大并顯著高于1和2水平，但是1和2水平之間差異不顯著。根據多重比較得出石豆蘭離體繁殖的最佳的激素配比為6-BA 0.40 mg/L和NAA 0.2 mg/L，此激素配比即6號培養基上鱗芽經過60 d的增殖培養，增殖了2.90倍。

3 結論與討論

本研究所用的石豆蘭屬植物其外植體消毒非常困難，因為在自然條件下外植體外部和內部都帶有較多的細菌，霉菌，尤其是蘭科植物，常年生活在空氣濕度大的環境中，加上生長周期較長的特點，外植體內外菌物非常豐富，給離體培養建立無菌材料時帶來巨大困難。

建立無菌起始材料時主要考慮的因素有外植體類型和消毒方法。選取外植體時要考慮材料來源、細胞全能性和消毒難易程度等，通過前期預實驗[4]，表明蘭科植物葉片再生能力非常弱，培養中逐漸黃化死亡；橫走莖已木質化，細胞全能性較低，也不適合選用[5-7]。本研究選取嫩芽和假鱗莖為外植體，發現假鱗莖內生菌多，尤其是生長周期更長的假鱗莖其內生菌更為豐富，經過切割后內生菌容易長出；此外鱗莖切塊易黃化，僅少數維持綠色但沒有分化，只有接入新形成的小球莖在未污染的情況下出現了生長。基于上述原因，通過假鱗莖難以建立無菌材料，本研究采用橫走莖前端新長出的嫩芽為外植體建立無菌材料。

植物外植體常采用化學方法消毒，主要考慮消毒劑的種類、濃度、時間，三個因素具有很強的相關性，使用力度越大，殺菌越徹底；若把握不好力度，外植體也會受到藥劑傷害死亡。怎樣在保證殺死菌物的同時不能對外植體造成傷害，保證較高的成活率，是建立無菌材料時考慮的重要因素。化學藥劑常采用的是HgCl2和NaClO。NaClO因具漂白作用，不適合綠體材料；HgCl2因效果好常被選用[8]。有研究報道超聲波輔助化學法能降低組培苗的污染率、提高成活率，大大降低HgCl2濃度和處理時間[9]。本研究表明HgCl2結合超聲比單獨使用HgCl2效果好，獲得較低的污染率和最高的成活率。內生菌豐富的外植體僅采用一般的化學、物理表面消毒法難以殺死內部微生物，一般采取消毒液中[10]或培養基中添加殺菌劑來抑制內生菌[11]，用到的殺菌劑有多菌靈、鏈霉素、慶大霉素、頭孢噻肟、青霉素等[12]。基于每種抗生物的殺菌譜限制，常采用多種抗生物聯合使用，還需考慮使用濃度和時間。前期預實驗發現石豆蘭內部含細菌和真菌，因此選用制菌霉素和萘啶酮酸兩種，經過濃度篩選確定75 mg/L制菌霉素和50 mg/L萘啶酮酸組合最好，90 d時統計污染率僅為20%，成活率為60%。

激素是植物器官分化的重要調控因子。本研究選用了6-BA和NAA 2種激素，兩種激素配比下，石豆蘭鱗莖切塊難以分化出原球莖或芽。本研究以帶根的整個假鱗莖為培養單元，芽主要從鱗莖的根基部分化出，也有少量芽從葉片中間或鱗莖表面分化出來。芽的分化會顯著受激素調控影響，6-BA 0.40 mg/L 和NAA 0.2 mg/L配比下，芽的增殖效果最好，為2.90倍。研究中發現石豆蘭植物分化容易，但生長緩慢，增殖周期較長，與近緣屬植物石斛的增殖類似[13-14]。關于石豆蘭屬植物的組織培養報道非常少，不同種植物所需的激素不同，李洪林等[6]在進行廣東石豆蘭組培時，增殖培養所用激素配比6-BA 2.5 mg/L和NAA 0.05 mg/L，增殖系數達4～5倍。

綜上所述，0.1%HgCl2結合超聲處理10 min較有效地殺死石豆蘭外植體表面微生物，培養基中添加75 mg/L制菌霉素和50 mg/L萘啶酮酸能有效抑制石豆蘭內生菌，建立了以鱗芽為起始材料的無菌材料。鱗芽在6-BA 0.40 mg/L和NAA 0.2 mg/L激素配比條件下增殖效果最好。