產細菌素腸球菌的分離及其抑菌譜的篩選

張 迅， 路振香， 朱元召， 孟婷婷

(安徽科技學院 動物科學學院，安徽 鳳陽 233100)

自20世紀初發現青霉素以來，各種各樣的新型抗生素陸續涌現，如β-內酰胺類、氨基糖苷類、四環素類、喹諾酮類、磺胺類等，為人類與畜牧業做出巨大的貢獻。但隨著抗生素應用的日益增多，抗生素的不規范、不合理使用以及濫用問題日益嚴重，造成病原菌耐藥性不斷增強，甚至出現了病原菌的多重耐藥性和交叉耐藥性，給臨床上的治療帶來了很大的挑戰[1-2]。而且，畜牧產品中存在的抗生素殘留問題，亦是威脅食品安全并影響人類健康的又一問題，這些問題使得尋找抗生素替代品的任務迫在眉睫。

細菌素是細菌產生的一種具有殺菌作用的蛋白質,只能作用于與其同種不同菌株的細菌，以及與其親緣關系相近的細菌。雖然，細菌素與抗生素相比抑菌譜相對較窄，但是在食品工業的長期應用中，細菌耐受性很少出現。因此，認為細菌素是目前最有發展前景的抗生素替代物[3]。腸球菌(Enterococcus)是一類重要的益生菌，在動物腸道內生活，能夠發酵糖類，并且能產生乳酸和細菌素等物質[4]。其中，具有廣譜抑菌作用的腸球菌已被應用于食品發酵、疾病治療和飼料添加劑等領域，例如，在歐洲，含有腸球菌的發酵劑常常被用于傳統奶酪的生產[5]；在我國，具有腸球菌的混合菌劑則被用于治療動物腹瀉和腸道炎癥等疾病[6]；而在動物飼料中添加乳酸菌制劑除了有一定的營養作用外，還可在一定程度上抑制腐敗菌及病原菌的生長繁殖，從而促進動物腸道微生態平衡，提高動物免疫力，改善動物健康[7-9]。

腸球菌是一種兼性厭氧的產乳酸的細菌，容易分離得到，培養條件簡單，適合于生產與應用。本試驗采集大鼠、小鼠、黃牛、奶牛、山羊、家兔、雞7種健康動物的糞便，用腸球菌選擇培養基進行腸球菌的分離培養，用LB液體培養基進行細菌素的生產，粗提，并對27株細菌采用圓紙片法進行發酵上清液和粗提細菌素的體外抑菌試驗，篩選抑菌譜，為細菌素的研究與應用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 分離自大鼠、小鼠、黃牛、奶牛、山羊、家兔、雞的糞便中采集的7株腸球菌、分離自雞、奶牛、黃牛、兔、小鼠的5株大腸桿菌、雞致病性大腸桿菌1、雞致病性大腸桿菌2、綠膿桿菌、枯草桿菌1、枯草桿菌2、金黃色葡萄球菌1、金黃色葡萄球菌2、分離自腸道、口腔、鼻腔、皮膚4株白色葡萄球菌、雞白色葡萄球菌(致病性)、產氣桿菌、沙門氏菌、雞沙門氏菌(致病性)，共計27株。

1.1.2 培養基 Pfizer腸球菌選擇培養基(PSE Agar)由青島高科園海博生物技術有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 腸球菌的分離 分別采集大鼠、小鼠、黃牛、奶牛、山羊、家兔、雞7種健康動物的糞便，在Pfizer腸球菌選擇培養基(PSE Agar)上劃線分離腸球菌，然后用燭缸法培養，于37 ℃培養18～24 h。

1.2.2 革蘭染色鏡檢 挑取腸球菌選擇培養基上的典型單個黑色菌落，革蘭染色，油鏡下觀察。

1.2.3 腸球菌細菌素的生產 分別將上述分離到的7株革蘭陽性球菌純培養，接種于LB液體培養基中，放入37 ℃恒溫箱培養48 h。

1.2.4 腸球菌發酵上清液的制備 取腸球菌的發酵液，于5 000 rpm，4 ℃條件下離心15 min，取上清液備用。

1.2.5 腸球菌細菌素的制備 腸球菌細菌素的提取方法參考Liu等[10]的方法，用硫酸銨鹽析法提取：取腸球菌的發酵液，5 000 rpm，4 ℃離心15 min，取上清液備用，棄去菌體沉淀。在上清液中，一邊緩慢攪拌，一邊慢慢添加經過研磨的硫酸銨粉末，使其終濃度為80%，過程中，可以看得有片狀沉淀浮現，然后置于4 ℃冰箱沉淀過夜。然后經12 000 rpm，4 ℃離心15 min，棄去上清液，將沉淀復溶于適量pH為7.0的磷酸緩沖液中，存放于4 ℃冰箱備用。

1.2.6 試驗菌的培養 將27株試驗菌劃線接種至普通營養培養基上，置37 ℃培養18～24 h，備用。

1.2.7 抑菌試驗

1.2.7.1 腸球菌發酵上清液抑菌試驗 將7種發酵上清液分別將適量圓紙片浸泡于其中，30 min后取出，晾干備用。采用圓紙片法對試驗菌分別進行抑菌試驗。

1.2.7.2 腸球菌細菌素抑菌試驗 將7種腸球菌粗提細菌素貯存液分別將圓紙片在其中浸泡30 min后，晾干，采用圓紙片法對試驗菌分別進行抑菌試驗。

2 結果與分析

2.1 腸球菌的分離與培養

用腸球菌選擇培養基從7種健康動物的糞便中分離到7株腸球菌，細菌在腸球菌選擇培養基上生長迅速，呈圓形黑色凸起，邊緣光滑整齊的菌落(圖1)。革蘭染色鏡檢均呈單個藍紫色球菌，為革蘭陽性球菌。

圖1 黃牛腸球菌菌落形態

2.2 腸球菌發酵上清液的抑菌試驗

7株腸球菌發酵上清液的抑菌試驗結果見表1，這7株腸球菌均有抑菌作用，但抑菌強度不同。大鼠腸球菌發酵上清液對黃牛腸球菌、白色葡萄球菌(腸道)、白色葡萄球菌(口腔)有抑制作用，小鼠腸球菌發酵上清液對雞大腸桿菌、白色葡萄球菌(口腔)有抑制作用，雞腸球菌發酵上清液對白色葡萄球菌(口腔)有抑制作用，兔腸球菌發酵上清液對黃牛腸球菌、雞大腸桿菌、奶牛大腸桿菌、白色葡萄球菌(腸道)、白色葡萄球菌(口腔)有抑制作用，黃牛腸球菌發酵上清液對雞大腸桿菌、白色葡萄球菌(腸道)有抑制作用，山羊腸球菌發酵上清液對黃牛腸球菌、白色葡萄球菌(口腔)有抑制作用，奶牛腸球菌發酵上清液對黃牛腸球菌、白色葡萄球菌(口腔)有抑制作用。而對腸球菌其他菌株、大腸桿菌其他菌株、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、產氣桿菌、枯草桿菌無抑菌效果。

表1 腸球菌發酵上清液抑菌試驗結果

注：Ⅰ:大鼠腸球菌；Ⅱ:小鼠腸球菌；Ⅲ:雞腸球菌；Ⅳ:家兔腸球菌；Ⅴ:黃牛腸球菌；Ⅵ:山羊腸球菌；Ⅶ:奶牛腸球菌的發酵上清液；“-”表示無抑菌作用。下同。

圖2 粗提細菌素對雞致病性大腸桿菌

2.3 腸球菌粗提細菌素的抑菌試驗

由表2可見，這7株腸球菌均有大小不同的抑菌作用(圖2)。大鼠腸球菌細菌素對雞致病性大腸桿菌1、小鼠大腸桿菌、產氣桿菌、白色葡萄球菌(腸道)、白色葡萄球菌(口腔)、雞白色葡萄球菌有抑制作用，小鼠腸球菌細菌素對雞致病性大腸桿菌1、雞致病性大腸桿菌2、小鼠大腸桿菌、產氣桿菌、雞白色葡萄球菌、沙門氏菌有抑制作用，雞腸球菌細菌素對雞致病性大腸桿菌1、小鼠大腸桿菌、雞白色葡萄球菌有抑制作用，兔腸球菌細菌素對雞致病性大腸桿菌1、小鼠大腸桿菌、雞白色葡萄球菌有抑制作用，黃牛腸球菌細菌素對雞致病性大腸桿菌1、雞白色葡萄球菌有抑制作用，山羊腸球菌細菌素對雞致病性大腸桿菌1、產氣桿菌、雞白色葡萄球菌有抑制作用，奶牛腸球菌細菌素對雞致病性大腸桿菌1、小鼠大腸桿菌、產氣桿菌、雞白色葡萄球菌有抑制作用。而對腸球菌、大腸桿菌其他菌株、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌(雞)、綠膿桿菌、枯草桿菌無抑菌效果。

由此可得，大鼠腸球菌和小鼠腸球菌的粗提細菌素抑菌譜較廣，小鼠腸球菌的粗提細菌素抑菌作用最好。

表2 腸球菌粗提細菌素抑菌試驗結果

3 結論與討論

動物腸道中的腸球菌對動物的胃酸和膽鹽的消化有較強的耐受作用，是益生菌來源的最好選擇，在本試驗中，采集包括大鼠、小鼠、黃牛、奶牛、山羊、家兔、雞等在內的7種健康動物的糞便作為分離材料。基于腸球菌在腸道生活的生活環境，用腸球菌選擇培養基來進行腸球菌的分離鑒定，再用革蘭氏染色、鏡檢進行進一步的確定，最終分離到7株腸球菌。采用硫酸銨鹽析法來提取細菌素，此法經濟簡單，易于操作，同時也可從一個方面證明腸球菌細菌素在高濃度鹽溶液中變性析出的蛋白質特性。但是鹽析的缺點是高濃度可能會使細菌素變性，從而使其抑菌活性降低[11]。所以，尋求更加經濟方便、易于操作、不會對細菌素的理化性質造成影響的提取方法，有待于進一步探究。

試驗所用的27株試驗菌，既包括致病菌，也有分離自健康動物體內或體表的常在菌。本研究采用圓紙片法，分別對所分離腸球菌的發酵上清液和粗提細菌素的進行了體外抑菌試驗。從試驗結果可知：腸球菌的粗制細菌素的抑菌效果跟上清液的抑菌效果相比，抑菌譜更廣，但抑制強度差距不大。腸球菌在代謝過程中可以產乳酸及細菌素，乳酸也具有一定的抑菌作用，在上清液中，酸與細菌素共同發揮抑菌作用，所以在試驗中需要單獨排除有機酸對指示菌的影響[12]。而粗提細菌素的提取液中，細菌素的純度及濃度更大，具有更好的抑菌效果，但差距并不明顯。

腸球菌細菌素具有抑菌作用，但抑菌效果不如抗生素的抑菌效果。一方面是因為細菌素相對于抗生素來說，抑菌譜較窄，只對有限的親緣關系比較近的幾種細菌有抑制生長作用；另一方面是可能是因為細菌素的純度與濃度不高，使得所泡圓紙片上的細菌素含量偏低[13]。在這個致病菌耐藥性日益嚴重的時代，對于細菌素的持續研究與深入探索，進一步在實際中投入與使用，希望能在緩解致病菌耐藥性和超級細菌方面發揮一定作用。但是，對于尋找具有廣譜抑菌作用的細菌素種類，仍需要進一步的篩選，而且，細菌素的產量與純度及用量問題，將是研究者們面臨的一大挑戰。或許，可以從提高細菌素抑菌比活力和利用DNA重組技術合成滿足人們要求的活性多肽或蛋白質等方面進行研究[14]。細菌素具有與抗生素飼料添加劑相近的有益作用，同時自身也具有許多優質特性，比如: 殺菌具有選擇性、無副作用、不在動物體內蓄積、無抗藥性，同時還具有耐低溫貯藏，熱穩定性等優質特性，所以細菌素在動物生產上的應用必將取得突破性進展[15]。

試驗從7種健康動物的糞便中分離出7株腸球菌，通過對其粗提細菌素進行體外抑菌試驗，結果表明：腸球菌細菌素具有抑菌作用，腸球菌細菌素不僅對白色葡萄球菌等革蘭陽性菌具有抑制作用，同時對大腸桿菌、沙門氏菌、產氣桿菌等革蘭陰性菌也表現出抑制作用，具有較廣的抑菌譜，為細菌素的研究與應用提供參考資料。