谷子白發病菌卵孢子重寄生真菌的分離與鑒定

閻玉婷，許永枝，何珠龍，高俊明

（1.山西農業大學農學院，山西 太谷 030801；2.沁水縣農業委員會，山西 沁水 048200）

谷子是一種起源于我國的古老農作物，被古人譽為“五谷之長”[1]，具有特殊的食療食補作用。近年來，隨著我國經濟水平和人民生活水平的不斷提高，人們的健康意識不斷增強，對特色小雜糧的需求量逐年增大，小雜糧單位面積種植收益也顯著提高[2]。沁州黃小米是我國四大名米中產業化生產運作最好的，以沁州黃為主的山西小米備受國內外華人青睞，巨大的市場需求和不斷提升的生產效益拉動了山西谷子產業的迅猛發展。但隨著谷子種植面積的不斷增加，輪作年限縮短，積年流行性的谷子白發病在山西各個谷子主產區都呈現了逐年加重的趨勢，在谷子白發病發生較為嚴重的沁水、沁縣、武鄉等地，其已成為谷子產業健康和綠色可持續發展的主要障礙。

谷子白發病（Foxtail millet downy mildew）是由卵菌門指梗霉屬的禾生指梗霉（Sclerospora graminicola）侵染引起的一種系統侵染性土傳病害。目前，生產上主要通過輪作和內吸性殺菌劑拌種的方法來防治該病害[3-6]。但隨著種植面積的擴大，輪作越來越困難，谷子生產對化學農藥的依賴性越來越強，用藥量也逐年增大。這種趨勢不利于綠色無公害小雜糧產業的健康發展，生產上迫切需要綠色無公害的生物防治技術。在自然界中廣泛而普遍存在的菌物間重寄生現象是植物病害生物防治的重要資源[7-8]。RAO 等[9]于1976年報道了一種寄生于谷子白發病菌卵孢子上的半裸鐮刀菌，WHIPPS 等[10]報道了寄生于腐霉屬、疫霉屬、指梗霉屬等真菌卵孢子上的一種鐮孢菌。而國內目前尚未見到有關卵孢子重寄生真菌的報道。

由于谷子白發病菌卵孢子是在植物組織內形成，在卵孢子上分離出的重寄生菌應屬于植物內生菌，如果這類植物內生菌對谷子生長發育沒有危害，并對促進谷子生長發育和提高抗逆性有益，可成為用于谷子白發病生物防治的候選菌。

本研究從山西省沁水縣谷子白發病病田采集到的病株上收集卵孢子，并從卵孢子上分離、純化和鑒定出3 株卵孢子重寄生真菌，以期為谷子白發病的生物防治研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為谷子白發病菌卵孢子，收集自山西省晉城市沁水縣的谷子白發病重病田谷子病株上。供試培養基為馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）[11]和皮拉依（Bilai′s）培養基[12]，2 種培養基 121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min 后備用。

1.2 重寄生真菌的分離

1.2.1 谷子白發病菌卵孢子的收集 用剪刀將采集到的谷子白發病病株上的發絲部分剪成2～3 cm的小段，使用0.04 mm 網篩對其進行過濾，收集過篩后的卵孢子粉于廣口瓶中保存。

1.2.2 卵孢子表面附著物及雜菌去除 稱取0.1 g干燥的孢子粉加入50 mL 離心管中，加入適量的無菌石英砂，并加入30 mL 無菌水。使用渦旋振蕩器渦旋6 min，靜置片刻，待卵孢子自然沉降后，用吸管吸除上清液。底部沉淀加入無菌水，按照上述操作連續重復多次。期間，制作臨時玻片在10×10 倍顯微鏡下觀察，待卵孢子懸浮液中及卵孢子表面無附著物時，即可用于卵孢子重寄生真菌的分離。

1.2.3 卵孢子重寄生真菌的分離 分離時，首先吸取凈化后的卵孢子懸浮液100 μL 加入直徑9 cm的滅菌空培養皿中，再用適量無菌水進行稀釋，直至在10×10 倍顯微鏡下觀察視野中卵孢子數量為25～30 個為止，然后用移液器吸取單個卵孢子移接到含鏈霉素的PDA 培養基上，每皿均勻間隔移接10 個卵孢子，25 ℃培養箱中黑暗培養，在卵孢子周圍出現菌落前，每天定時顯微觀察一定數量的卵孢子，對卵孢子表面重寄生真菌的生長情況進行拍照。每個樣本采集點的卵孢子至少應移接出100 個單卵孢子。由于谷子白發病菌屬專型寄生菌，即便卵孢子萌發也不能在培養基上形成白發病菌菌落，因此，卵孢子周圍形成肉眼可見菌落就可斷定其是重寄生菌。

1.2.4 卵孢子重寄生真菌的純化 從單卵孢子上形成的重寄生真菌菌落邊緣挑取菌絲轉接到PDA培養基上，倒置于25 ℃培養箱中黑暗培養進行初步純化，觀察菌絲生長情況。培養3 d 后采用尖端菌絲分離法繼續純化。純化3～4 次經觀察無雜菌，以確保分離得到的菌落為純菌株。將分離純化后的菌株分別進行編號保存備用。

1.3 重寄生真菌的鑒定

1.3.1 形態學鑒定 將分離得到的重寄生真菌接種到直徑 9 cm 的 PDA，Bilai's 培養基上，在 25 ℃培養箱黑暗培養4～7 d，觀察培養基內菌落形態，挑取菌絲進行顯微觀察。對于分離出的重寄生真菌，采用菌落觀察的方法，結合顯微觀察中菌絲的形態特征，根據產孢結構、分生孢子形態、大小、分生孢子著生狀態以及分生孢子梗分枝情況等，參照《真菌鑒定手冊》[13]、鐮刀菌種類鑒定的方法等相關文獻[14-17]對其進行初步鑒定。

1.3.2 分子生物學鑒定 采用分子生物學技術中rDNA-ITS 序列分析進行未知種的鑒定[18-21]。

1.3.2.1 DNA 提取 DNA 提取參考博日試劑盒的提取方法并略有改動。

1.3.2.2 PCR 擴增 采用真菌rDNA ITS 的通用引物 ITS1（5′-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3′）和 ITS4（5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′）對重寄生真菌基因組DNA 進行擴增。2 種引物均由上海生物工程有限公司合成。其擴增體系為：2×PCR Mix 12.5 μL，上下游引物各 1 μL，DNA 模板 1μL，最后用雙蒸水定容到25 μL。擴增程序為：95 ℃預變性 4 min；95 ℃變性 30 s，52 ℃退火 30s，72 ℃延伸1 min，共30 個循環；最后72 ℃延伸10 min。

1.3.2.3 瓊脂糖電泳 取5 μL PCR 擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳。電泳結束后，取出凝膠，在凝膠成像系統中觀察并拍照，將具有特異性條帶的產物送至上海生物工程有限公司進行擴增產物的純化與測序，獲得PCR 產物序列。

1.3.2.4 Blast 分析及序列處理 將測序結果中的序列提交至NCBI 中，與GenBank 中的相關序列進行同源性比較，查找相似性較高的序列，采用MEGA（6.0）軟件中的臨近法（neighbor-joining，NJ），進行1 000 次Bootstrap 檢驗計算系統發育樹中節點的置信度，對重寄生真菌的DNA 序列進行多重序列比較，構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定結果

根據重寄生真菌菌落的生長速率、菌落顏色、菌落形態等一系列特征進行鑒定。得出分離得到的3 種重寄生真菌均為鐮孢菌，命名為菌株LD1，LD2，LD3。

2.1.1 菌株LD1 的形態學鑒定 菌落形態：Bilai's培養基上培養4 d，菌落直徑4.1～4.6 cm。PDA 培養基上培養4 d，菌落直徑4.3～4.9 cm，蛛網狀，生長速度中等。菌落顏色呈粉白色，氣生菌絲致密，菌落背面淡紫粉色，外緣菌絲出現消解現象。

分生孢子：小型分生孢子較多，卵形至橢圓形，無隔。小型分生孢子串生，有時可在孢子鏈頂端形成類似假頭狀著生，量度為（4.8～16.8）μm×（2.6～3.6）μm。大型分生孢子鐮刀形，3～5 隔，量度為（27.3～45.2）μm×（3.6～4.5）μm。

產孢細胞：單、層出復瓶梗產孢。

厚垣孢子：無厚垣孢子（圖1）。

2.1.2 菌株LD2 的形態學鑒定 菌落形態：Bilai's培養基上培養4 d，菌落直徑4.5～4.7 cm。PDA 培養基上培養4 d，菌落直徑4.8～5.3 cm，生長迅速。菌落顏色呈淡桃紅色至紫色，氣生菌絲致密，羊毛狀，菌落背面淡紫色，表面具有粉狀物。

分生孢子：小型分生孢子較多，紡錘形至卵形，基部稍平展。小型分生孢子呈鏈狀排列，有時可在孢子鏈頂端形成類似假頭狀著生。量度為（3.4～12.5）μm×（1.7～3.8）μm。

產孢細胞：單瓶梗產孢。

厚垣孢子：無厚垣孢子（圖2）。

2.1.3 菌株LD3 的形態學鑒定 菌落形態：Bilai's培養基上培養4 d，菌落直徑3.5～4.3 cm。PDA 培養基上培養4 d，菌落直徑4.6～5.6 cm。氣生菌絲初期白色，棉絮狀，菌落背面淺黃色，后期產生深褐色色素。

分生孢子：中型分生孢子，紡錘形，多為1 分隔。大型分生孢子鐮刀型，稍彎，多為3～5 分隔。量度為（28.3～37.3）μm×（4.5～5.5）μm。

產孢細胞：單、復瓶梗，多芽產孢共存。

厚垣孢子：存在極少厚垣孢子，球形，著生于菌絲中部或頂部（圖3）。

2.2 分子鑒定

根據形態特征，利用真菌的通用引物ITS1 和ITS4，對分離純化得到的3 株重寄生真菌進行序列測定。電泳時使用的Marker 為2 000 bp，其中，750 bp為最亮條帶。從圖4可以看出，3 種重寄生真菌ITS序列的PCR 結果均在500 bp 左右。

2.2.1 菌株LD1 的分子鑒定 菌株LD1 的ITS 區共測序531 個堿基，在NCBI 中經過Blast 比對發現，該序列與GenBank 數據庫中多個層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum）菌株的相似性均達到99%。系統發育分析表明，菌株LD1 與菌株MG543771.1的親緣關系最近，與Fusarium 屬其他種類關系相對較遠（圖5），結合該菌株的形態特征，將其鑒定為層出鐮孢菌，屬于鐮孢霉屬李瑟組。

2.2.2 菌株LD2 的分子鑒定 菌株LD2 的ITS 區共測序523 個堿基，在NCBI 中經過Blast 比對發現，該序列與GenBank 數據庫中多個擬輪枝鐮孢菌（Fusarium verticillioides）菌株的相似性均達到99%。系統發育分析也表明，菌株LD2 與菌株KJ598859.1的親緣關系最近，與Fusarium 屬其他種類關系相對較遠（圖6），結合該菌株的形態特征，將其鑒定為擬輪枝鐮孢菌，屬于鐮孢霉屬李瑟組。

2.2.3 菌株LD3 的分子鑒定 菌株LD3 的ITS 區共測序526 個堿基，在NCBI 中經過Blast 比對發現，該序列與GenBank 數據庫中多個半裸鐮孢菌（Fusarium incarnatum）菌株的相似性均達到99%。系統發育分析也表明，菌株LD3 與菌株KP641161.1 的親緣關系最近，與Fusarium 屬其他種類關系相對較遠（圖7），結合該菌株的形態特征，將其鑒定為半裸鐮孢菌，屬于鐮孢霉屬直孢組。

3 結論與討論

本研究通過對寄生于谷子白發病菌卵孢子上的真菌進行分離純化，共得到3 株重寄生真菌。采用形態特征和顯微觀察初步確定菌株的分類地位，得出3 株重寄生真菌均屬于鐮孢菌。經過分子鑒定，本試驗共分離得到的3 株重寄生真菌LD1，LD2，LD3 分別屬于李瑟組的層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum）、擬輪枝鐮孢菌（Fusarium verticillioides）和直孢組的半裸鐮孢菌（Fusarium incarnatum），得出了谷子白發病菌卵孢子上的重寄生真菌主要以鐮孢菌屬為主的結論，與RAO 等[9]報道的結果相符。另外，試驗前期發現，存在叢梗孢屬和地霉屬生長于谷子白發病菌卵孢子上的現象，后期的分離純化試驗中并沒有發現與其相關的菌株，但是并不排除其為重寄生菌的可能性。本研究將傳統的形態學觀察與現代分子生物學技術相結合，結果更加準確可信。接下來可以通過研究3 株重寄生真菌對于谷種萌發、谷子生長發育等的影響來確定它們所具有的生防潛力，該結果將為谷子白發病的生物防治提供一定的理論依據。