熱應激對豬睪丸死亡受體Fas及其配體FasL表達與定位的影響

冀 睿，范小瑞，申 慧，岳美杉，劉怡慧，賀俊平

（山西農業大學動物科技學院，山西 太谷 030801）

體溫下2～8 ℃為睪丸環境中精子發生的理想溫度[1]。哺乳動物睪丸長時間暴露于高溫環境，生精上皮中各級生精細胞受損，嚴重影響精子發生，導致生殖能力下降[1-4]。有研究報道，公豬在夏季精液品質下降，導致產仔數降低、生育能力下降[5]，TUNEL 法檢測到大量生殖細胞凋亡[6]。陰囊局部熱刺激可導致細胞凋亡信號上調[6]，成年食蟹獼猴睪丸43 ℃處理30 min 后，生精細胞的調亡比例升高[7]；43 ℃熱處理牛睪丸支持細胞1 h 后，細胞凋亡比例降低[8]；43 ℃恒溫水浴處理小鼠睪丸15 min 后，睪丸組織質量明顯減少、生殖細胞凋亡率升高[9]。

死亡受體 Fas（Factor associated suicide）及其配體FasL 是細胞凋亡外源性通路的重要基因[10]。細胞膜表面的FasL 可與Fas 蛋白結合，通過死亡結構域聚合為三聚體復合物FADD（Fas-associated death domain），該復合物的N 末端與凋亡執行蛋白procaspase-8 進而誘導procaspase-3 活化，最終引發生精細胞凋亡[11-12]。Fas/FasL 系統是一種免疫應答的調控機制，該機制可以抑制由Fas 引起的活化淋巴細胞的凋亡[13-14]。Fas 配體（FasL，CD-95）是一種Ⅱ型膜結合蛋白，屬于腫瘤壞死因子（TNF）家族，能以死亡受體Fas 為誘導而引發細胞凋亡[15]。

研究報道，Fas，FasL 在人[16]、猴[7]、牛支持細胞[6]、大鼠[17]、小鼠[12，15]睪丸組織中均有表達，揭示 Fas，FasL 與哺乳動物精子發生有著密切關系。而在細胞凋亡的調控信號通路中，死亡受體Fas 及其配體FasL在熱應激豬睪丸的表達是否受影響還未見報道。

本研究以豬為試驗對象，建立豬睪丸熱應激模型，探索細胞凋亡基因Fas，FasL 在熱應激豬睪丸組織中的表達情況，以闡明Fas，FasL 在熱應激豬睪丸生殖細胞中的影響，旨在為研究Fas，FasL 在豬睪丸中精子發生的分子機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為9 頭14月齡性成熟長白公豬。

1.2 試驗方法

試驗隨機建立3 組熱應激模型，每組3 頭，分別為對照組、環境熱應激組（EHS）、局部熱應激組（LHS）。其中，對照組不作任何處理，室溫（20～25 ℃）圈養在豬舍中，每天正常給水、喂食；環境熱應激組每日將豬飼養在37～40 ℃豬舍中3 h，結束后趕回室溫豬舍，連續處理7 d；局部熱應激組的豬用自制的可控溫加熱墊覆蓋在左側睪丸陰囊表面（42 ℃加熱1 h）。各組豬睪丸處理結束后迅速將豬睪丸組織摘取，其中一部分組織切成1.5 cm3小塊置于Bouin 液固定，用于石蠟組織切片的制作；剩余部分凍存于液氮，用于總RNA、總蛋白的提取。采用qRTPCR 與 Western Blotting 檢測 Fas，FasL 的 mRNA 與蛋白的相對表達量，通過免疫組織化學染色觀察生殖細胞的定位。

1.2.1 總 RNA 提取、cDNA 合成以及 qRT-PCR 檢測 各試驗組豬睪丸總RNA 由Trizo（lInvitrogen，USA）法提取，1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測其在睪丸組織是否表達完整，采用ND-1000 濃度儀測定總RNA 濃度。cDNA 由反轉錄試劑盒（TAKARA，中國）合成，按照產品說明書標注的反應體系進行基因組DNA 去除，在200 μL 的EP 小管中加入并混勻 2 μL DNA Wipeout Buffer（7×） 以及 1 μg 總RNA，反應體系為14 μL，將EP 管常規放入PCR儀，并設定42 ℃恒溫條件反應2 min；反應結束后，cDNA 合成，反應體系為：繼續在小管中加入并混勻4 μL Quantiscript RT Buffer（5×），1 μL RT Primer Mix，1 μL Reverse-transcription master mix 以及 14 μL TotalRNA，將EP 管常規放入PCR 儀，設定加熱反應條件：42 ℃，30 min；95 ℃，3 min；4 ℃冷卻。cDNA模板于 -80 ℃保存。Fas，FasL 基因的 CDS 序列以NCBI 提供的Sus scrofa mRNA 全序列為標準，使用Primer 5.0 軟件設計并通過華大基因公司合成qPT-RCR 擴增引物（表1）。

表1 qRT-PCR 引物序列及片段大小與其擴增條件

qRT-PCR 所需相關試劑由TAKARA 試劑盒提供，18S rRNA 作內參基因，基因在樣品的擴增過程中，Fas，FasL 與內參均3 次重復；在八連管中加樣結束后，將管放入實時熒光定量PCR 儀（Strata gene Agilent，USA），根據退火溫度設置儀器。FasmRNA，FasLmRNA 在對照組和試驗組豬睪丸中相對表達量由儀器給出的擴增曲線CT 值，結合18S rRNA對樣品的標準化，通過2-ΔΔCT計算得出。

1.2.2 Western Blotting 檢測 各組豬睪丸組織總蛋白通過蛋白裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，中國）與現配的PMSF 提取，濃度由ND-1000濃度儀測定。SDS-PAGE 凝膠（武漢博士德生物工程有限公司，中國）配制的成型膠板中，蛋白樣品在每格的上樣量為200 μg，加樣結束后在80 V 穩定電壓電泳1.5 h，電泳結束后將有目的條帶的膠條轉移至NC 膜，轉膜1 h，在5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST 浸洗，分別加入第1 抗體：Fas（400 倍稀釋，多克隆兔抗，北京博奧森生物技術有限公司，中國）、FasL（300 倍稀釋，多克隆兔抗，北京博奧森生物技術有限公司，中國）、GAPDH（2 500 倍稀釋，多克隆兔抗，北京博奧森生物技術有限公司，中國），密封，4 ℃層析柜搖床14～16 h；一抗孵育結束，搖床復溫 30 min，TBST 浸洗 3 次，每次 10 min，加入第2 抗體：山羊抗兔IgG（6 000 倍稀釋，北京康為世紀生物科技有限公司，中國），37 ℃孵育 1 h，TBST 浸洗 6 次，每次5 min；通過高靈敏度發光試劑（北京康為世紀生物科技有限公司，中國）曝光NC 膜，暗室壓膠片曝光蛋白條帶。Fas 蛋白、FasL 蛋白及內參GAPDH蛋白的試驗結果由Image J 與相對表達量分析。

1.2.3 免疫組織化學 二甲苯與梯度酒精對石蠟切片進行透明、脫水，內源性過氧化物酶、羊血清封閉液、生物標記素、鏈霉菌抗生素以及DAB 顯色液由邁新試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司，中國）提供。每片滴加 50 μL 3%H2O2，37 ℃恒溫孵育10 min，PBS 緩沖液（pH=7.4）浸洗 3 次，每次 3 min；每片滴加50 μL 羊血清封閉液，37 ℃恒溫孵育10 min，甩凈，在陽性組各滴加 50 μL 第1 抗體：Fas（200 倍稀釋，多克隆兔抗，北京博奧森生物技術有限公司，中國）、FasL（150 倍稀釋，多克隆兔抗，北京博奧森生物技術有限公司，中國），陰性對照組滴加50 μL 正常非免疫兔血清；室溫搖床30 min 充分混勻，4 ℃孵育 12～14 h；搖床復溫 30 min，PBS 浸洗3 次，每次 3 min，每片滴加 50 μL 第2 抗體：多聚化山羊抗兔IgG（北京康為世紀生物科技有限公司，中國），37 ℃孵育 30 min，PBS 浸洗 3 次，每次 3 min；DBA 現配，暗光下在各陽性組顯色30 s～120 min，蘇木精復染6 min，蒸餾水浸洗2 次，每次2 min；梯度乙醇與純二甲苯分別進行脫水、透明，封片，光學顯微鏡獲取抗體在切片中細胞定位的試驗結果。棕色表示抗體在細胞免疫陽性，陽性顏色的深淺與范圍表示抗體的表達水平。

1.3 數據分析

所有與相對表達量相關的試驗數據均由SPSS 16.0 進行單因素方差分析（One-way ANOVA）與顯著性檢驗，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。試驗數據均以“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 FasmRNA與FasLmRNA相對表達量

qRT-PCR 結果顯示，FasmRNA 在對照組中相對表達量為1.029±0.251，與對照組相比，環境熱應激組相對表達量為1.293±0.192，是對照組1.256 倍，但差異不顯著（P＝0.304＞0.05）；局部熱應激組相對表達量為4.123±0.566，是對照組的4.007 倍，且差異極顯著（P＜0.01）（圖1-A）；FasLmRNA 在對照組中的相對表達量為1.001±0.040，與對照組相比，環境熱應激組相對表達量為0.570±0.062，是對照組的0.569 倍，且差異極顯著（P＜0.01），局部熱應激組相對表達量為1.509±0.108，是對照組1.508 倍，且差異極顯著（P＜0.01）（圖1-B）。

2.2 Fas與FasL蛋白在豬睪丸中的相對表達量

Western Blotting 檢測結果顯示，多克隆兔抗Fas（34 ku）與 FasL（31 ku）在各組豬睪丸蛋白提取物中均有陽性免疫反應條帶（圖2-A）。Fas 在對照組中的蛋白相對表達量為0.708±0.0738，在環境熱應激組與局部熱應激組中的蛋白相對表達量較對照有所升高，分別為 1.208±0.064，1.904±0.053，分別為對照組的1.706 倍和2.692 倍，且差異達極顯著水平（P＜0.01）（圖2-B）；FasL 在對照組中的蛋白相對表達量為0.735±0.035，在環境熱應激組的蛋白相對表達量為0.344±0.011，低于對照組，是對照組的0.468 倍，且差異達極顯著水平（P＜0.01），在局部熱應激組的蛋白表達量為0.887±0.026，高于對照組，為對照組的1.208 倍，且差異達極顯著水平（P＜0.01）（圖2-C）。

2.3 免疫組織化學試驗

2.3.1 Fas 在豬睪丸中免疫組織化學染色 Fas 在對照組豬睪丸中免疫組織化學反應陽性物（棕色）著色于精母細胞細胞膜，在精原細胞細胞質呈弱陽性表達（圖3-A）；與對照組相比，Fas 在環境熱應激組中于精原細胞細胞質與精母細胞細胞膜呈陽性反應（圖3-B），在局部熱應激組中于精母細胞細胞膜與圓形精子細胞的細胞核、細胞膜與細胞質呈陽性反應（圖3-C）。陰性對照切片以動物非免疫血清（羊）替作一抗，未發現特異性染色（圖3-D）。

2.3.2 FasL 在豬睪丸中免疫組織化學染色 FasL在對照組豬睪丸中主要定位于支持細胞的胞質、圓形精子細胞的胞質與胞核、精母細胞的胞核與細胞膜（圖4-A）。與對照組相比，FasL 在環境熱應激組中在圓形精子細胞強陽性表達，支持細胞弱陽性表達（圖4-B），在局部熱應激組中的支持細胞、圓形精子細胞以及精母細胞均為強陽性表達（圖4-C）。陰性對照切片以動物非免疫血清（羊）替作一抗，未發現特異性染色（圖4-D）。

3 結論與討論

Fas 及FasL 在各類組織和細胞中有凋亡調控的作用[18]，有研究表明，Fas 抗體表達在生精細胞、FasL 抗體表達在支持細胞[16-17]，揭示 Fas 及 FasL 與精子發生密切相關。

本試驗結果顯示，FasLmRNA 與蛋白的表達量在環境熱應激組中低于對照組，在局部熱應激組高于對照組，結果與43 ℃恒溫水浴加熱小鼠睪丸[9]、熱處理牛支持細胞[8]結果相近，揭示FasL 在睪丸局部高溫條件下參與調節生殖細胞的凋亡，環境高溫中FasL 可能以自分泌或旁分泌的形式作用于細胞凋亡的調控。本研究中，免疫組織化學染色結果顯示，Fas 抗體主要免疫陽性著色（棕色）于生精細胞及精子細胞中，已有大量文獻報道并證實[19-20]。與對照組相比，Fas 在環境加熱組中，精原細胞的細胞質的免疫陽性反應物著色度深于對照組，揭示精原細胞是熱應激敏感的細胞類型；在局部熱應激組中，Fas 抗體陽性表達于圓形精子細胞，揭示圓形精子細胞對瞬時熱應激敏感。

對照組中，FasL 抗體在支持細胞、圓形精子細胞以及精母細胞都有表達，支持細胞上表達FasL 已有文獻證實[21-23]，研究表明，FasL 表達于生殖細胞[10]，后經證實，FasL 也表達在精子細胞[24]與精母細胞[25]。在局部熱應激組中，FasL 抗體強陽性表達，推測睪丸表面溫度高，睪丸組織內生殖細胞細胞膜上的蛋白活性升高，死亡受體FasL 大量表達。

對照組中FasL 免疫陽性反應物著色深于環境熱應激組，推測環境熱刺激處理后，Fas，FasL 抗體的表達可能不依賴于外源性通路或者由于死亡受體Fas 敏感性太高，少量配體FasL 足夠與其結合，揭示了生物體自我保護的一種凋亡方式。

本研究中發現，FasmRNA 和Fas蛋白在環境熱應激組與局部熱應激組中的表達均升高，揭示Fas對死亡受體FasL 的敏感性升高。生殖細胞與支持細胞表達的FasL 都以旁分泌或自分泌形式作用于鄰近的生殖細胞，促使生殖細胞凋亡。熱應激引起凋亡基因Fas，FasL 在豬睪丸組織中蛋白與mRNA相對表達量的變化，以及Fas 與FasL 抗體在睪丸生殖細胞中定位的改變，揭示Fas，FasL 可能與熱誘導的豬繁殖率下降有關。