7種植物枯萎病病原真菌的鑒定

鄭瑞瑞，安 麗，何曉婷，郝曉娟，曹 揮

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801）

植物枯萎病是世界范圍內(nèi)重要的病害威脅之一，主要危害番茄、西瓜、甜瓜等生產(chǎn)。隨著瓜果蔬菜保護(hù)地的發(fā)展以及現(xiàn)代生活對(duì)瓜果蔬菜的需求量日益增大，單一品種的長(zhǎng)時(shí)間種植使枯萎病菌及毒素在土壤內(nèi)大量積累[1]。枯萎病菌是由鐮刀菌引起的土傳病害，發(fā)病迅速且突然，可危害茄科、蘭科、十字花科、葫蘆科、芭蕉科等多種作物，引起植物減產(chǎn)、植物萎蔫，在濕潤(rùn)的條件下導(dǎo)致萎蔫、腐爛，一旦發(fā)生難以根除，成為制約植物生產(chǎn)的重要影響因素之一[2-4]。

鐮刀菌是一種重要的真菌類(lèi)群，其中包含尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、擬輪枝鐮刀菌（Fusarium verticillioides）、三線鐮刀菌[5]（Fusarium tricinctum）、燕麥鐮刀菌（Fusarium avenaceum）[6]等。鐮刀菌的序列活性大，侵入植物及對(duì)植物有害的信號(hào)多樣，使植物的免疫系統(tǒng)難以識(shí)別，可以在多個(gè)地區(qū)、不同植物寄主上發(fā)病，使枯萎病的防治愈加困難[7]。鐮刀菌屬是真菌中最重要的植物病原物和產(chǎn)毒真菌，所產(chǎn)生的毒素是一種蛋白質(zhì)、脂多糖（HPLP）的復(fù)合物[8]。如鐮刀菌酸、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），可堵塞植物導(dǎo)管或者使植物的細(xì)胞組織壞死[9]，在人工菌落培養(yǎng)基上的主要表現(xiàn)是菌落顏色為紅、黃、紫等色素[10]。

枯萎病病原菌屬無(wú)性孢子類(lèi)鐮孢菌屬（Fusari－um oxysporum Schl.）[11]。枯萎病病原菌的菌絲體和分生孢子梗繁茂，鐮刀菌會(huì)產(chǎn)生3 種孢子——小型分生孢子、大型分生孢子和厚垣孢子。小型分生孢子為卵圓形至橢圓形，無(wú)色，單孢或雙孢，單生或串生，一般無(wú)隔；大型分生孢子為橢圓形至鐮刀形，無(wú)色，有3～5 個(gè)隔，兩端略彎；厚垣孢子是從分生孢子或者老的菌絲體上產(chǎn)生，也會(huì)產(chǎn)生擬菌核[12-13]。

尖孢鐮刀菌接在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的生物學(xué)特征是菌落正面菌絲均為白色，菌絲短絨狀，繁殖4～5 代后菌落的顏色變淡，菌絲氣生狀。菌落背面顏色有白色、淺紫等[14]。

真菌的鑒定主要是形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定依據(jù)真菌菌落顏色、菌絲生長(zhǎng)狀況、孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及有無(wú)橫隔的特征進(jìn)行顯微形態(tài)分類(lèi)鑒定[15]。分子鑒定是通過(guò)真菌DNA 的一些特異性序列，如核糖體保守序列、致病蛋白及相應(yīng)真菌的特異性序列等遺傳物質(zhì)來(lái)分析每個(gè)物種之間內(nèi)在的遺傳變異，鑒定同屬、種之間的細(xì)小差異，從而對(duì)物種的種屬進(jìn)行鑒定[16]。現(xiàn)在鐮刀菌常用的分子鑒定的手段有EF-1α 引物[7]、核糖體DNA、線粒體小亞基核糖體、β-微管蛋白及翻譯延伸因子等[5]。rDNA 的序列分析廣泛應(yīng)用于真菌各個(gè)等級(jí)水平的系統(tǒng)學(xué)研究，其主要是利用基因間隔序列（Internal transcribed spacer，ITS）[8]引物引出核糖體基因的一段保守序列，多數(shù)真菌均可利用這一引物，在一定程度上也減少不同引物的差異性[17]。

本研究主要針對(duì)3 個(gè)地區(qū)、6 種植物上分離得到的鐮刀菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并結(jié)合分子學(xué)鑒定明確其屬、種，為枯萎真菌病害的鑒定提供理論依據(jù)，為今后抑菌試驗(yàn)和抑菌機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料及試劑 7 種植物枯萎病原菌包括辣椒枯萎菌（2016年7月，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站）；番茄枯萎菌 1（2018年5月，山西太谷）；番茄枯萎菌2（2016年7月，重慶郊區(qū)）；蘭花枯萎菌（2016年9月，河南靈寶）；甜瓜枯萎菌（2018年5月，山西太谷）；茄子枯萎菌（2016月7月，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站）；西瓜枯萎菌（2016年7月，重慶郊區(qū)）。馬鈴薯（PDA，PD）培養(yǎng)基；真菌DNA 快速抽提試劑盒，2×Easy Taq 酶 Mix，Marker（上海生物工程）；瓊脂、葡萄糖、無(wú)水乙醇（分析純）等。

1.1.2 主要儀器 壓力蒸汽滅菌（G154DWS）、潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD），超純水機(jī)（HF Super PWUV），高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Sorvall ST 16R Centrifuge），BIO-RAD 凝膠成像儀（GelDocXR）。

1.2 試驗(yàn)方法

2018年10月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.1 真菌的分離與純化 參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行枯萎病病原真菌的分離與純化。

1.2.2 真菌的種屬鑒定

1.2.2.1 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 利用固體培養(yǎng)基玻片法，依據(jù)真菌菌落顏色、菌絲生長(zhǎng)狀況、孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及有無(wú)橫隔的特征進(jìn)行顯微形態(tài)分類(lèi)鑒定[19]。

1.2.2.2 分子學(xué)鑒定 本試驗(yàn)利用rDNA-ITS 引物ITS1—TCCGTAGGTGAACCTGCGG 和 ITS4—TCCT CCGCTTATTGATATGC，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，退火溫度為55 ℃，30 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)下降0.5 ℃。1%瓊脂糖凝膠電泳110 V，25 min 進(jìn)行檢測(cè)，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，驗(yàn)證DNA 提取及PCR 擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同枯萎病害病原真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

在真菌的識(shí)別中，有形態(tài)學(xué)的識(shí)別，諸如菌落的形態(tài)、顏色以及在培養(yǎng)基的生長(zhǎng)狀態(tài)，還有孢子的形態(tài)，菌絲的形態(tài)以及其在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)，厚垣孢子的形態(tài)及大小等。不同植株枯萎菌落形態(tài)以及孢子的生長(zhǎng)狀態(tài)如圖1所示。

辣椒枯萎菌：菌落背面邊緣白色，中間為暗紅色，呈放射狀生長(zhǎng)。菌落正面菌絲致密、白色，絨毛狀，邊緣為規(guī)則放射狀，菌落中央下陷。菌絲頂端分叉，生長(zhǎng)圓滑，菌絲頂端膨大成分生孢子。大型分生孢子長(zhǎng)橢圓短棒狀，小型分生孢子短棒狀。

番茄枯萎菌1：菌落背面橙黃色，中央顏色較深，呈中央放射狀生長(zhǎng)，邊緣呈包圍形。菌落正面菌絲白色，呈絨毛狀。菌絲密集程度不一。菌絲頂端膨大脫落形成分生孢子，生長(zhǎng)期為橢圓形。大型分生孢子長(zhǎng)紡錘形，厚垣孢子產(chǎn)生于分生孢子中，一個(gè)分生孢子中有2 個(gè)小橢圓狀孢子。菌絲多頂端分叉增生，頂端平整或彎鉤狀，菌絲有隔。

番茄枯萎菌2：菌落背面中央的顏色較深，為紫紅色，菌落顏色整體為白色，整體中央放射狀生長(zhǎng)。菌落邊緣卷曲狀生長(zhǎng)。菌落正面菌絲白色，較密集，蛛網(wǎng)狀生長(zhǎng)。大型分生孢子鐮刀型，有隔（0～3 個(gè)），小型分生孢子短棒狀。

蘭花枯萎菌：菌落背面淡黃色，邊緣白色，放射狀生長(zhǎng)。菌落正面緊密、絨毛狀，菌絲白色。菌落形狀多不規(guī)則，在培養(yǎng)5 代后逐漸規(guī)則。菌絲上部分枝為樹(shù)叉狀，分叉短小，頂端膨大圓潤(rùn)或彎鉤狀。大型分生孢子短棒狀，但兩端略尖，小型分生孢子橢圓短棒狀。

甜瓜枯萎菌：菌落背面淡黃色，菌絲密集、邊緣纖細(xì)，菌絲粗大，向上凸起生長(zhǎng)，毛氈狀。菌絲頂端膨大圓滑，分叉短小。菌絲頂端分裂出分生孢子，菌絲有隔。大型分生孢子橢圓形短棒狀，小型分生孢子橢圓形短棒狀。

茄子枯萎菌：菌落背面深橘黃色，次之橘黃色，外緣淺橘色，呈放射狀生長(zhǎng)，邊緣白色、發(fā)散式。菌絲稀疏網(wǎng)格狀，邊緣絮狀。菌絲有隔，分叉多短小，頂端尖細(xì)，頂端膨大脫落形成分生孢子，短棒狀。大型分生孢子紡錘形，由菌絲的中間細(xì)胞分裂產(chǎn)生。小型分生孢子卵圓形或者小紡錘形。

西瓜枯萎菌：菌落背面顏色暗紅色，邊緣有暈圈，中部出現(xiàn)深色的枝狀條紋。菌落正面菌絲致密，呈毛氈狀，邊緣稀疏，呈放射狀。菌絲頂端分叉，彎鉤狀。厚垣孢子卵圓形。

依據(jù)上述的孢子形態(tài)以及菌落顏色，確定采集的3 個(gè)地區(qū)、6 種植物的枯萎病病原菌的均為鐮孢屬真菌[6]。

2.2 病原真菌的分子學(xué)鑒定

利用18S 和28S rDNA 的上下游引物序列，得到7 種不同寄主的枯萎病病原菌菌株的序列結(jié)果（表1），并與NCBI Blast 上的已知序列進(jìn)行比對(duì)，確定病原真菌種或亞種。

表1 不同植株枯萎病病原菌ITS 引物鑒定結(jié)果

由表1可知，利用rDNA-ITS 鑒定7 種植物枯萎病菌種的種屬，結(jié)果表明，辣椒枯萎菌、蘭花枯萎菌、番茄枯萎菌1 為鐮孢屬鐮刀菌（Fusarium redolens）；番茄枯萎菌2、甜瓜枯萎菌、西瓜枯萎菌為鐮孢屬尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）；茄子枯萎菌為鐮孢屬擬輪枝鐮刀菌（Fusarium verticillioides）。

3 結(jié)論與討論

本研究從3 個(gè)地區(qū)、6 種植物枯萎植株進(jìn)行分離純化枯萎病原菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察菌落顏色、分生孢子形狀、菌絲生長(zhǎng)情況，表明分離純化的病原菌均為鐮孢屬真菌。rDNA-ITS 鑒定分離菌種的種屬結(jié)果表明，辣椒枯萎菌、蘭花枯萎菌、番茄枯萎菌1 為鐮孢屬鐮刀菌（Fusarium redolens）；番茄枯萎菌2、甜瓜枯萎菌、西瓜枯萎菌為鐮孢屬尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）；茄子枯萎菌為鐮孢屬擬輪枝鐮刀菌（Fusarium verticillioides）。

本試驗(yàn)形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果和分子學(xué)鑒定分離純化的病原菌的屬結(jié)果相同，均屬鐮孢屬真菌。在形態(tài)學(xué)鑒定中，病原菌可產(chǎn)生不同顏色的毒素，但是孢子的差異不能鑒定病原菌的種或?qū)；汀＠梅肿訉W(xué)鑒定可以鑒定至種或者專(zhuān)化型，鑒定出尖孢鐮刀菌及擬輪枝鐮刀菌。試驗(yàn)結(jié)果表明，鐮孢屬菌株具有多樣性，包括鐮孢屬菌、尖孢鐮刀菌、擬輪枝鐮刀菌等。枯萎病病原菌生長(zhǎng)地區(qū)及寄主對(duì)枯萎病菌是否為鐮孢屬?zèng)]有影響。本試驗(yàn)為之后進(jìn)行的抑菌試驗(yàn)及抑菌機(jī)制的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

在真菌的分離、純化及回接過(guò)程中，因真菌生長(zhǎng)條件的改變，會(huì)出現(xiàn)毒素分布不均、孢子生長(zhǎng)狀態(tài)不一或不產(chǎn)生、菌絲生長(zhǎng)形態(tài)變異、厚垣孢子出現(xiàn)困難、分生孢子在形態(tài)學(xué)上差異小，很難區(qū)分多種菌株之間的差異，進(jìn)而使直接利用形態(tài)學(xué)鑒定鐮孢菌菌種或?qū)；陀欣щy。而且對(duì)菌絲、孢子的描述困難，且對(duì)形態(tài)觀察的顯微儀器和拍攝要求極高，容易對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成錯(cuò)誤的鑒定。所以，本試驗(yàn)利用分子學(xué)技術(shù)rDNA-ITS 輔助鑒定親緣關(guān)系較近的真菌如種、屬和屬以上真菌。