Cd2+對克氏原螯蝦肝胰腺NF-κB p65表達的影響

宋昌霞，魏克強

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030006）

近年來，我國水域環境的污染狀況日益嚴峻，重金屬鎘是典型的污染物之一，能對水生動物造成氧化應激、免疫損傷等毒性效應，嚴重危害了水生動物健康[1-4]。克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）是我國主要的淡水養殖品種之一，還是一種潛在的水質環境污染的指示生物[5]。肝胰腺是甲殼動物重要的免疫和解毒器官[6-7]。研究表明，NF-κB 是進化保守的氧化還原敏感的轉錄因子，其家族成員p65（RelA）在天然免疫反應中具有重要作用[8]。目前還發現，在甲殼動物等低等無脊椎動物細胞內也存在該蛋白的類似物，其mRNA 主要在肝胰腺表達和分布[9]。

本研究以亞致死濃度的Cd2+為脅迫因子，利用免疫組化法（IHC）分析了不同濃度Cd2+對克氏原螯蝦肝胰腺NF-κB p65 表達的影響，旨在為甲殼動物的免疫毒理學研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

健康克氏原螯蝦（體長為（9±0.5）cm，體質量為（21.2±4.2）g），購于太原市五龍口水產市場。試驗前于曝氣充足的玻璃缸中暫養7 d，水溫為（16±1）℃，pH 值為 6.5±0.2，試驗前 24 h 不再喂食。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑有多聚甲醛、無水乙醇、二甲苯、石蠟、蘇木素、伊紅、氨水、中性樹膠、檸檬酸等，均為國產分析純；NF-κB p65 多克隆抗體（Proteintech，武漢），兔IgG SABC 免疫組化試劑盒（博士德，武漢），DAB 試劑盒（索萊寶，北京）。

儀器主要有石蠟切片機（Leica RM2255，德國），CO2恒溫培養箱（HH.CP-7 型，上海），光學顯微鏡（Olympus BX51，日本）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 染毒與取樣 采用靜態水質接觸染毒法。確定 96 h 半致死濃度（LC50≈42 mg/L）后，隨機分為3 個處理組：健康對照組和1.0，5.0 mg/L Cd2+染毒組，每組6 只。染毒96 h 后，隨機取3 尾，置于冰上麻醉，解剖取肝胰腺組織，4%多聚甲醛固定48 h。

1.3.2 肝胰腺組織H.E.染色 其參照文獻[10]的方法進行。將固定的肝胰腺組織進行常規石蠟包埋、切片（5 μm），蘇木素、伊紅染色后，中性樹膠封片，顯微鏡觀察拍照。

1.3.3 免疫組化法檢測 參照文獻[11-12]的方法，石蠟切片常規脫蠟，免疫組化三步法（SABC 法）檢測 NF-κB p65 的表達，DAB 顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，顯微鏡觀察拍照。每張切片隨機選取5 個視野，使用Image-ProPlus 6.0 軟件讀取每個視野下陽性物質表達區域的平均光密度值（MOD）。

1.4 數據處理

采用SPSS 17.0 軟件處理數據，所有結果均以均數±標準差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 組織切片病理觀察

H.E.染色顯示，健康螯蝦的肝胰腺組織結構完整，由肝小管及上皮細胞組成，主要為B 細胞（存儲細胞）和R 細胞（分泌細胞）；在Cd2+脅迫下，肝胰腺組織破損，肝小管官腔變窄，R 細胞排列紊亂、少量B 細胞破裂（圖1-A）。

2.2 肝胰腺組織的NF-κB p65表達

免疫組化分析表明，正常狀況下，NF-κB p65主要在B 細胞的胞質中表達且維持在較低的水平。Cd2+脅迫下，其表達水平分別是對照的6 倍和12 倍（P＜0.01），且 5 mg/L 組與 1 mg/L 組間差異顯著（P＜0.01）（圖1-B～E）。

3 結論與討論

核轉錄因子 NF-κB 由 NF-κB/Rel 蛋白家族構成，通常多以p65 和p50 的異二聚體形式存在。一般情況下，NF-κB 處于非活化狀態，與抑制蛋白IκB 結合處于胞質中。當細胞被刺激后，會使 IκB 發生磷酸化，從而與NF-κB 脫離，p65 從細胞質中遷移進入細胞核內，調控免疫有關的靶基因的轉錄表達[13-15]。

肝胰腺是甲殼動物主要的解毒器官，也是重金屬Cd2+蓄積的主要組織[16]。毒性Cd2+導致超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等活性氧自由基（ROS）的產生增多，激活氧化還原敏感的轉錄因子[17]。一些研究表明，NF-κB 是 ROS 的主要靶點[18-20]。本研究的結果顯示，Cd2+暴露能夠導致肝胰腺組織的NF-κB p65 蛋白含量顯著升高（P＜0.01）；低質量濃度Cd2+處理的表達量明顯低于高質量濃度處理，這可能由于在低質量濃度的Cd2+暴露后，機體產生的過量ROS，通過抗氧化防御系統清除了部分ROS。而在高質量濃度Cd2+暴露后，機體產生的過量ROS無法通過自身清除，進一步激活NF-κB 信號通路，使NF-κB p65 蛋白大量表達。譚樹華等[6]研究了鎘對克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化系統的影響，也表明了類似的規律，即低濃度鎘脅迫下典型抗氧化酶活力增加，高濃度暴露則對機體造成抗氧化防御系統的損傷。這提示，細胞NF-κB p65 的表達與胞內的ROS 水平密切相關，這可能是水體重金屬鎘暴露導致甲殼動物的毒性效應之一，其如何影響螯蝦的細胞免疫、體液免疫，還需進一步深入研究。