Myf5在不同生長階段小鼠心肌中的定位與表達(dá)

李經(jīng)緯，薛霖莉，2，曹 靖，冀云燕，李藝?yán)祝稳A偉，羅小毛，于秀菊，赫曉燕，王海東

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院，山西 太谷 030800；3.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京 102442）

近年來，有關(guān)心血管疾病的患病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，并且心血管疾病給患者的身心健康和生活質(zhì)量帶來了嚴(yán)重的不良影響[1]。例如，心功能不全、心肌鈣化、心肌肥厚、先天性心臟病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生均與心臟相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的突變和功能失調(diào)有著十分緊密的關(guān)系[2]。研究調(diào)控心臟相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)機(jī)制是細(xì)胞分子生物學(xué)研究中的熱點(diǎn)，有利于對心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有更加精確的判斷。

調(diào)節(jié)因子 MRFs（Myogenic Regulatory Factors）家族可編碼多種不同的轉(zhuǎn)錄因子，包括MyoD（Myf3），Myogenin（MyoG），Myf5 和 Myf6（MRF4），它們是控制肌細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，跟肌纖維的數(shù)量、大小有著密切的關(guān)系[3]。在結(jié)構(gòu)上，調(diào)節(jié)因子MRFs 家族均含有一段大小為80 個(gè)氨基酸的高度保守的中央蛋白基序（motif）形成的堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)包含的Basic 結(jié)構(gòu)和HLH 螺旋結(jié)構(gòu)分別是與DNA 相互作用的區(qū)域和與其他因子相互作用的位點(diǎn)也是調(diào)控的重要功能結(jié)構(gòu)區(qū)域[4]。調(diào)節(jié)因子MRFs 家族成員能夠通過對不同E-Box 識別和結(jié)合，從而選擇性的對肌肉特異性基因進(jìn)行選擇性的表達(dá)調(diào)控[5]。在動物體發(fā)育的不同階段，MRFs 中的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在肌肉發(fā)育過程中相互協(xié)同作用，對肌組織發(fā)育發(fā)揮著不同的表達(dá)調(diào)控作用，NAIDU 等[6]研究表明，Myf5在上游能夠調(diào)控肌細(xì)胞開始向成肌纖維分化。

目前，通過建立斑馬魚模型已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些與心臟的特化與分化、心臟祖細(xì)胞的遷移、心血管的形成以及心臟功能的一些基本的調(diào)節(jié)因子和調(diào)控機(jī)制[7]。YANG 等[8]通過敲除斑馬魚 Myf5，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，斑馬魚的斜紋肌、外直肌、胸骨肌、舌骨肌和所有咽喉部的相關(guān)肌肉的發(fā)育受到了明顯的抑制。隨著特定基因敲除技術(shù)的提高和組織誘導(dǎo)表達(dá)工具盒的廣泛運(yùn)用，在已有的模式組織中用已經(jīng)了解存在的基礎(chǔ)科研知識篩選心臟發(fā)育疾病的候選基因相當(dāng)熱門。RUDNICKI 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，將小鼠的Myf5 和MyoD 基因都敲除后，缺失Myf5 和MyoD 的小鼠肌纖維和成肌細(xì)胞生成受到了顯著抑制。敲除MyoD的小鼠在胚胎發(fā)育過程中基本上和正常小鼠一致[10]，但是Myf5 的表達(dá)量在祖細(xì)胞中大幅提高，并且試驗(yàn)組小鼠四肢的發(fā)育顯著延遲[11]。RUDNICKI 等[12]在試驗(yàn)中通過敲除小鼠Myf5 發(fā)現(xiàn)，雖然小鼠四肢發(fā)育正常，但是小鼠的MyoD 的表達(dá)明顯延遲，而且小鼠的肌節(jié)發(fā)育也明顯變緩。

有關(guān)Myf5 的研究主要集中在骨骼肌發(fā)育方面的表達(dá)調(diào)控，但對Myf5 在心肌發(fā)育過程中表達(dá)調(diào)控作用的研究甚少。

本試驗(yàn)通過對幼年、性成熟、體成熟和老年4 個(gè)不同發(fā)育階段的小鼠心肌組織采用HE 染色法、免疫組織化學(xué)法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，對Myf5 在小鼠心肌表達(dá)情況進(jìn)行定性和定量分析，初步探討Myf5 在正常小鼠心肌不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，為進(jìn)一步揭示Myf5 在心臟發(fā)育的病理狀況差異性和調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 隨機(jī)選取健康的幼年（1 周齡）、性成熟（3-4 周齡）、體成熟（8 周齡）和老年（12 周齡）發(fā)育階段的小鼠各4 只，試驗(yàn)小鼠均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)室教學(xué)示范中心提供。

1.1.2 試劑 Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR 試劑盒，均購自TaKaRa 公司；免疫組化試劑盒，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Myf5 兔多克隆抗體，購自武漢三鷹公司；Myf5 上下游引物，購自北京六合華大基因科技有限公司。

1.2 石蠟切片制作

選取健康的幼年、性成熟、體成熟和老年發(fā)育階段的小鼠各4 只，采用斷頸法處死小鼠，取其心肌組織，之后將心肌組織進(jìn)行橫切，并用Bouins 固定液固定。之后經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋4 步處理后使用切片機(jī)切成6 μm 厚的切片。

1.3 HE和免疫組織化學(xué)染色

1.3.1 小鼠心肌組織HE 染色 將心肌組織切片經(jīng)二甲苯和不同梯度濃度酒精脫蠟、復(fù)水后，依次用蘇木精和伊紅染色，之后進(jìn)行脫水、透明、中性樹膠封片，并于顯微鏡下觀察。

1.3.2 小鼠心肌組織免疫組織化學(xué) 切片脫蠟、復(fù)水后，用PBS 緩沖液進(jìn)行沖洗，擦凈，枸櫞酸鹽微波抗原修復(fù)30 min，冷卻后滴加內(nèi)源性過氧化物酶封閉液（solution A），之后室溫孵育10 min，并用PBS緩沖液沖洗后滴加羊血清工作液（solution B），室溫孵育20 min 并滴加一抗（1∶30 稀釋），陰性對照滴加PBS 代替一抗，將切片置于4 ℃冰箱過夜；次日，室溫孵育30 min 后用PBS 緩沖液沖洗并滴加生物素標(biāo)記羊抗兔二抗工作液（solution C），之后37 ℃孵育30 min 并用PBS 緩沖液沖洗；然后滴加HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素（solution D）后在37 ℃孵育30 min，依次在切片組織上滴加30 μL 的DAB 顯色劑并用PBS 緩沖溶液進(jìn)行沖洗，經(jīng)蘇木精復(fù)染、脫水、透明，最后用中性樹膠進(jìn)行封片、顯微鏡下觀察。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI 檢索小鼠的Myf5 基因序列，使用Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR 擴(kuò)增引物，并對引物的特異性進(jìn)行初步檢測，引物由北京華大公司合成。引物序列和產(chǎn)物長度列于表1。

表1 引物序列和產(chǎn)物長度

1.5 RNA提取和qRT-PCR

Trizol 法提取幼年、性成熟、體成熟、老年4 個(gè)年齡階段小鼠的心肌組織總RNA 并測定濃度，之后反轉(zhuǎn)錄并使用熒光定量試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 10 s，30～35 個(gè)循環(huán)。內(nèi)參條件同上進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣本至少3 個(gè)重復(fù)，反應(yīng)完成后，運(yùn)用 2-ΔΔCT法計(jì)算 Myf5 在幼年、性成熟、體成熟、老年4 個(gè)年齡階段小鼠心肌組織的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育階段小鼠心肌形態(tài)學(xué)特征分析

不同發(fā)育階段的小鼠心肌組織HE 染色結(jié)果顯示，隨著小鼠的發(fā)育成熟，肌纖維的橫切面逐漸增大，細(xì)胞核逐漸變大，中心化現(xiàn)象減少。細(xì)胞核和肌纖維面積的比值也呈現(xiàn)漸變性的縮小，發(fā)育到老年階段比值達(dá)到最小。同時(shí)，組織間隙也越來越變寬，特別是在體成熟階段組織之間的間隙明顯增多，到達(dá)老年階段組織間隙達(dá)到最大（圖1）。

2.2 不同發(fā)育階段小鼠心肌Myf5蛋白表達(dá)情況分析

不同發(fā)育階段小鼠心肌組織的免疫組化結(jié)果顯示，Myf5 在4 個(gè)不同發(fā)育階段的小鼠心肌組織細(xì)胞中均有表達(dá)，表達(dá)部位為細(xì)胞核。而且在幼年階段小鼠心肌組織胞核著色程度最深，其次是老年的小鼠心肌組織，在性成熟和體成熟小鼠心肌組織中表達(dá)最低，說明Myf5 在幼年階段小鼠心肌組織的表達(dá)量最高，其他發(fā)育階段的表達(dá)量較低（圖2）。

2.3 Myf5基因PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

經(jīng)過PCR 篩選發(fā)現(xiàn)，條帶3 沒有出現(xiàn)非特異性的條帶和拖尾現(xiàn)象，而且產(chǎn)量高，片段大小符合設(shè)計(jì)，得出最適合的退火溫度為60 ℃（圖3）。

2.4 不同發(fā)育階段小鼠心肌Myf5 mRNA表達(dá)差異分析

根據(jù) Myf5 擴(kuò)增曲線（圖4）可以發(fā)現(xiàn)，Myf5 基因擴(kuò)增曲線和內(nèi)參擴(kuò)增曲線均呈現(xiàn)“S”型曲線，有平穩(wěn)的平臺期。將實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測出的Myf5 在不同發(fā)育階段小鼠心肌組織表達(dá)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得出Myf5 基因在不同發(fā)育階段小鼠心肌組織的相對表達(dá)量有顯著性差異（圖5），即隨著小鼠的發(fā)育成熟，Myf5 在不同發(fā)育階段心肌組織中的表達(dá)呈現(xiàn)先降低后升高趨勢，與性成熟、體成熟階段相比，幼年心肌組織的表達(dá)量呈現(xiàn)差異極顯著（P＜0.01），與老年階段差異不顯著（P＞0.05）。Myf5 從幼年開始到老年、體成熟、性成熟階段表達(dá)依次降低，性成熟階段達(dá)到最低。

3 討論

Myf5 是調(diào)節(jié)因子MRFs 家族的重要成員，在不同的時(shí)空通過對肌細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)行調(diào)控，并與成肌纖維的數(shù)量以及肌衛(wèi)星細(xì)胞修復(fù)再生有著緊密的聯(lián)系。CASES 等[13]在研究中發(fā)現(xiàn)，Myf5 是調(diào)節(jié)因子MRFs 家族中最早開始被誘導(dǎo)表達(dá)，即在小鼠的胚胎發(fā)育過程就已經(jīng)開始了表達(dá)。調(diào)節(jié)因子MRFs 家族的各個(gè)成員之間在表達(dá)調(diào)控上有著緊密的相互聯(lián)系，因此，Myf5 對MRFs 家族其他成員的表達(dá)起到了關(guān)鍵性的誘導(dǎo)作用。LUDOLPH 等[14]在對Myf5 在非洲爪蟾的胚胎發(fā)育過程中作用的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，Myf5 過表達(dá)會激活非肌細(xì)胞系，從而使得生肌節(jié)代償性增大。并且RUDNICKI 等[12]在試驗(yàn)中通過敲除小鼠Myf5 發(fā)現(xiàn)，雖然小鼠四肢發(fā)育正常，但是小鼠的MyoD 的表達(dá)明顯延遲，而且小鼠的肌節(jié)發(fā)育也明顯變緩。敲除MyoD 的小鼠在胚胎發(fā)育過程中基本上和正常小鼠一致[10]，但是Myf5 的表達(dá)量在祖細(xì)胞中大幅提高，并且MyoD 敲除組小鼠四肢的發(fā)育顯著延遲[11]。RUDNICKI 等[9]通過試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，將小鼠的Myf5 和MyoD 基因都敲除后，缺失Myf5 和MyoD 的小鼠肌纖維和成肌細(xì)胞生成受到了顯著抑制。這些試驗(yàn)都說明，Myf5 在肌組織的表達(dá)起著重要調(diào)控作用，并且KNOLL 等[15]證實(shí)了Myf5 在小鼠的成肌細(xì)胞和肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化的過程中均起著重要調(diào)控作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著小鼠的發(fā)育成熟，Myf5 在心肌組織的表達(dá)呈現(xiàn)出一定關(guān)聯(lián)性。MONTARRAS 等[16]研究表明，Myf5 主要與成肌細(xì)胞的特化與增殖有關(guān)，而Myf5 對肌細(xì)胞的分化具有更重要作用。Myf5 在功能上與成肌細(xì)胞數(shù)目有著緊密的聯(lián)系，并且在小鼠出生時(shí)心臟組織基本發(fā)育完全。隨著小鼠的發(fā)育成熟，Myf5 在心肌組織的表達(dá)會呈現(xiàn)降低的趨勢，這與本試驗(yàn)的結(jié)果基本吻合。

吳瓊彪等[17]通過對烏珠穆沁羊生長不同發(fā)育階段中骨骼肌MRFs 家族基因在組織的特異性表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，MRFs 家族基因相對表達(dá)量為6月齡＞12月齡＞18月齡，6月齡的基因表達(dá)量最高，與其他月齡之間相比有顯著差異，與本研究結(jié)果一致。黎威等[18]研究發(fā)現(xiàn)，馬身豬和大白豬背最長肌中Myf5 mRNA 相對表達(dá)量均為初生時(shí)最高，30日齡次之，之后逐漸降低。陳禧等[19-20]對Myf5 基因在第10，14，18，22，27 天的鴨胚和出生后 1 周雛鴨的小腸平滑肌的相對表達(dá)量研究發(fā)現(xiàn)，Myf5 基因在不同的發(fā)育階段中表達(dá)呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢，第10 天表達(dá)量最高。綜上所述，從出生后隨著動物的發(fā)育成熟，Myf5 無論在平滑肌組織、骨骼肌組織還是心肌組織中的表達(dá)均呈現(xiàn)降低的變化趨勢。

SANTERRE 等[21]通過基因轉(zhuǎn)染的方法成功的將小鼠Myf5 基因轉(zhuǎn)染進(jìn)牛的基因組后，發(fā)現(xiàn)被轉(zhuǎn)染的牛能夠表達(dá)小鼠的Myf5 基因并且產(chǎn)生了異位性的肌肉。而且LINDON 等[22]對Myf5 在成肌細(xì)胞表達(dá)調(diào)控的研究發(fā)現(xiàn)，Myf5 在不同的時(shí)空中有著不同的表達(dá)模式。總之，Myf5 基因表達(dá)與心肌正常發(fā)育調(diào)控有著明顯的相關(guān)性，但是在患有心臟疾病的病理情況下，Myf5 表達(dá)變化的研究還不夠充分，依然需要對Myf5 在心臟發(fā)育的病理狀況差異性表達(dá)和調(diào)控機(jī)制做進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在小鼠心肌組織發(fā)育的不同階段中，Myf5 表達(dá)在幼年鼠最高，性成熟鼠最低，其呈現(xiàn)先降低后緩慢上升的趨勢，并且幼年階段與其他的不同發(fā)育階段呈現(xiàn)極顯著性差異，表明Myf5 表達(dá)與小鼠心肌組織發(fā)育具有相關(guān)性。