基于GC-MS分析酸雨與鎘復合脅迫對玉米幼苗代謝物的影響

王振濤，解靜芳，李 萌，陳佳月

（1.山西大學環境與資源學院，山西 太原 030006；2.中國科學院上海硅酸鹽研究所，上海 200050）

酸雨（Acid rain，AR）是指 pH 值小于 5.6 的降水[1]，可造成土壤酸化、傷害動植物、腐蝕建筑物等[2-3]。鎘（Cadmium，Cd）是含有毒性的重金屬元素[4]，環境中存在的Cd 會對植物產生毒害效應，干擾植物新陳代謝，嚴重時會導致植物枯萎甚至死亡[5-6]。土壤中Cd 的溶解度隨AR 強度的增大而增加，而AR 和Cd 復合脅迫會破壞植物的生長環境[7]。有研究表明，短期不同濃度Cd 脅迫誘使紅樹根系分泌的有機酸含量增多[8]，Cd 誘導菠菜多種氨基酸、多種糖類物質、蘋果酸和檸檬酸含量升高[9]，AR 會對植物光合系統、呼吸作用及物質代謝產生影響[10]。

AR 與Cd 作為2 種重要的環境污染物，均會對植物的生長和代謝造成影響。目前，國內外對AR和Cd 的相關研究多集中于二者復合脅迫對植物生長、生理及光合作用等的影響方面[11-12]，而從代謝的角度分析二者復合脅迫對玉米幼苗的作用機制還未見報道。氣相色譜-質譜（GC-MS）方法具有高分離效能的毛細管色譜柱和高靈敏度的質譜檢測定性能力[13]，其對于代謝物的鑒定具有一定的優勢，樣品進行衍生化處理后，可以檢測到的代謝物包括糖類、氨基酸、有機酸等極性較大的化合物，也能檢測到極性較小的化合物如脂肪酸。

本試驗通過GC-MS 方法研究AR 單一脅迫和AR 與Cd 復合脅迫對玉米幼苗代謝物的影響，以期厘清其影響作用機制，為AR 與Cd 聯合污染對作物生長的干預和土壤污染修復提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與設備

供試玉米品種為大豐30。氯化鎘CdCl2·2.5H2O（分析純）購自天津市化學試劑二廠；CP224C 電子天平（奧豪斯儀器有限公司，常州），高速冷凍離心機（Hermle Z-36HK，德國），超純水機（上海力康生物醫療科技控股有限公司），制冰機（Scotsman，上海），滅菌鍋（上海博迅醫療生物儀器股價有限公司），DSQ 單四級桿氣相色譜質譜儀（GC-MS，美國Thermo Fisher 公司）。

1.2 試驗設計

試驗分設單一AR 和AR 與Cd 聯合染毒2 個大組，其中，單一AR 染毒組分為5 組，即空白組（CK）、A 組（pH＝5 的酸雨）、B 組（pH＝4 的酸雨）、C 組（pH＝3 的酸雨）、D 組（pH＝2 的酸雨）；AR 與Cd 聯合染毒組也分為5 組，即E 組（Cd2+染毒質量分數為 5 mg/kg）、F 組（pH＝5 且 Cd2+染毒質量分數為 5 mg/kg 的酸雨）、G 組（pH＝4 且 Cd2+染毒質量分數為 5 mg/kg 的酸雨）、H 組（pH＝3 且 Cd2+染毒質量分數為 5 mg/kg 的酸雨）、I 組（pH＝2 且 Cd2+染毒質量分數為5 mg/kg 的酸雨）,每組4 盆，每盆種8 粒玉米，每盆土壤質量為180 g。待幼苗發芽率達到75%后[14]，通過定時澆灌噴灑方式完成染毒，染毒量為50 mL，染毒連續14 d，取幼苗進行代謝物的測定。

1.3 代謝物分析

1.3.1 樣品前處理 稱取液氮研磨后的幼苗60 mg于2 mL EP 中，加入1 mL 甲醇和水混合溶液（體積比為1∶1），超聲提取30 min，樣品在3 000 r/min條件下離心10 min，取50 μL 上清液于進樣小瓶中，在真空冷凍干燥器中吹干。在吹干后的殘渣中加入質量濃度為20 g/L 的鹽酸甲氧胺吡啶溶液50 μL（含正二十四烷0.1 g/L），37 ℃反應90 min，再加入50 μL N- 甲基 -N-（三甲基硅烷） 三氯乙酰胺（MSTFA）＋1%三甲基氯硅烷（TMMCS）溶液，37 ℃反應 30 min[15]，0.22 μm 有機相膜過濾，待測。

1.3.2 GC-MS 分析條件 用Thermo Fisher DSQ 對待測物進行1.0 μL 不分流進樣，接著用DB-5MS 毛細管柱進行色譜分離，進樣口溫度為280 ℃，載氣為氦氣，載氣流速為1.0 mL/min，柱溫初始為80 ℃，保持2 min，接著以10 ℃/min 的升溫速率升溫至140 ℃，保持 1 min，再以 4 ℃/min 的升溫速率升溫至240 ℃，保持2 min，最后以5 ℃/min 的升溫速率升溫至300 ℃，并保持3 min，設溶劑延遲為8 min。質譜儀采用電子碰撞（EI）模式（70 eV）離子化[9]，傳輸線溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，數據采集掃描模式為全掃描，掃描質核比范圍為50～650。

1.4 數據分析

采用SIMCA 14.0 統計軟件進行主成分分析（PCA），采用偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）模型和t 檢驗法對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理下玉米幼苗代謝物的識別

GC-MS 結果分析，對代謝物進行庫識別，篩選匹配度大于70%的化合物作為目標代謝物（匹配度表示檢索物質與庫中標準物質的相似程度，用百分數表示），共篩選出76 種代謝物，再通過篩選質量控制樣品中RSD＜30%的代謝物作為后續分析的代謝物，一共49 種。

2.2 不同處理下玉米幼苗差異代謝物的篩選

對AR 單一處理和AR 與Cd 復合脅迫處理的玉米幼苗代謝物進行PCA 分析（圖1），t[1]為第1主成分，t[2]為第2 主成分，試驗結果顯示，AR 單一處理和AR 與Cd 復合脅迫處理后2 個系列表現分離良好，分別為圖1中實線圈與虛線圈；不同濃度酸雨的單一處理結果顯示，組間分離良好（CK，A，B，C，D 組），不同濃度 AR 與 Cd 復合脅迫處理結果顯示，組間亦分離良好（E，F，G，H，I 組），因此，不同濃度的酸雨在單一脅迫和與Cd 復合脅迫均會對玉米幼苗造成不同程度的損傷。

通過OPLS-DA 模型分析，通過變量的載荷大小尋找差異代謝物，載荷越大說明對樣本點分類貢獻越大。本研究以變量重要性投影（variable import ance in the projection，VIP）＞1.0 和 t 檢驗（P＜0.05）為差異代謝物選擇標準，與CK 組相比，A 組、B 組、C 組和 D 組分別篩選出 11，11，10，11 種差異代謝物（表1）；與 E 組相比，F 組、G 組、H 組和 I 組分別篩選出 10，13，13，9 種差異代謝物（表2）。

表1 酸雨脅迫后玉米幼苗差異代謝物VIP 值

表2 酸雨與鎘復合脅迫后玉米幼苗差異代謝物VIP 值

2.3 不同處理下玉米幼苗差異代謝物的變化

2.3.1 氨基酸代謝 AR 單一暴露后，與空白對照組相比，甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、丙氨酸和β-丙氨酸含量顯著升高。復合脅迫與同強度AR 單一脅迫相比，玉米幼苗代謝物與AR 單一暴露一致（表3）。

表3 酸雨與鎘復合脅迫后玉米幼苗差異代謝物含量 μg/mg

2.3.2 有機酸代謝 AR 單一脅迫時，與空白對照相比，玉米幼苗有機酸代謝物中檸檬酸顯著升高；乳酸和蘋果酸含量顯著降低。復合脅迫與同強度AR 單一脅迫相比，有機酸代謝物變化同AR 單一脅迫一致。總體來看，2 種脅迫對玉米幼苗有機酸含量的影響是一致的（表3）。

2.3.3 糖類代謝 與對照組相比，AR 單一脅迫誘導玉米幼苗中蔗糖和葡萄糖含量隨著酸雨pH 值減小而顯著上升，AR 與Cd 復合脅迫后玉米幼苗中蔗糖和葡萄糖含量同樣隨著酸雨pH 值減小而升高，與同強度AR 單一脅迫相比，復合脅迫對玉米幼苗中蔗糖和葡萄糖含量顯著升高。總體來看，單一與復合脅迫均誘導玉米幼苗中大部分糖類含量升高，總糖類含量增加（表3）。

2.3.4 抗逆物質代謝 與空白對照相比，AR 單一脅迫對玉米幼苗中抗逆物質腐胺含量的變化顯著升高；與同強度AR 單一脅迫相比，復合脅迫對玉米幼苗中抗逆物質含量的變化有腐胺和肌醇，其中，肌醇含量先降后升，是復合脅迫的特有差異代謝物（表3）。

3 討論

3.1 不同處理對玉米幼苗氨基酸代謝的影響

環境脅迫會對植物體內氨基酸代謝造成影響。甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸和絲氨酸是糖異生的前體氨基酸[16]，在植物體內乙醇酸代謝過程中磷酸乙醇酸被氧化為甘氨酸，然后甘氨酸在線粒體中轉化為絲氨酸，絲氨酸在四氫葉酸代謝中至關重要，主要調節-CH3的運輸[17]，且絲氨酸的積累是植物老化加速的一個信號[18]。單一和復合脅迫均誘導這2 種氨基酸含量升高，表明玉米幼苗體內蛋白質分解水平增加，糖異生途徑水平增高，AR 與Cd 復合脅迫使玉米幼苗光呼吸受到抑制，氨循環受阻。脯氨酸含量在一定程度上可反映植物的抗逆性。胡雁春[19]研究發現，隨AR 強度的增大，三葉草脯氨酸含量呈遞增趨勢；孫盛等[20]研究表明，隨Cd 處理濃度的增大，黃瓜幼苗葉片脯氨酸含量增加。這與本研究中AR 單一脅迫、AR 與Cd 復合脅迫均誘導玉米幼苗脯氨酸含量增加的結果一致，表明脯氨酸可抵御Cd 的毒害作用。同時，AR 可誘導植物體內蛋白質溶解酶活性增強，蛋白質分解加快，促使脯氨酸含量升高。

3.2 不同處理對玉米幼苗有機酸代謝的影響

植物在呼吸過程中，通過三羧酸循環（Tricarboxylic acid cycle，TCA）形成一系列有機酸。重金屬脅迫下，植物體會分泌大量的草酸、檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸等有機酸[21]。蘋果酸和檸檬酸是植物TCA中2 種重要的有機酸。本研究中，單一脅迫下，蘋果酸含量降低而檸檬酸含量升高，說明植株體TCA處于較穩定的狀態；復合脅迫下，蘋果酸和檸檬酸含量均顯著增加，表明復合脅迫阻礙了TCA 的正常運行，玉米幼苗生理情況遭到破壞，TCA 遭到破壞主要是由Cd2+造成的。乳酸累積在細胞內，會使胞質溶膠酸化，影響酶代謝。本研究結果顯示，2 種脅迫均誘導乳酸含量降低，且2 種脅迫乳酸含量下降程度相差不大，表明玉米幼苗乳酸含量的降低主要是由酸雨造成的。

3.3 不同處理對玉米幼苗糖類代謝的影響

糖類是植物光合作用和呼吸作用的重要碳化合物，在植物生長發育過程中發揮著重要的作用。在代謝過程中，葡萄糖為植物抗逆提供能量。本研究結果表明，2 種脅迫均誘導玉米幼苗葡萄糖含量增加，啟動了糖異生途徑中多種氨基酸和有機酸含量的增加，同時，葡萄糖的大量積累提示玉米幼苗的光合作用受到影響[22]。復合脅迫與同強度AR 單一脅迫相比，葡萄糖、蔗糖含量均顯著升高，表明Cd2+的存在加大了酸雨對糖類的積累，更大強度地破壞了玉米幼苗的光合作用，抑制其生長，這與KIEFFE 等[23]研究得出的糖類物質的積累是Cd 抑制植物生長的一個重要因素的結果一致。

3.4 不同處理對玉米幼苗抗逆物質的影響

腐胺屬于多胺類物質，可增強植物對環境的耐受力[24]。本研究結果顯示，2 種脅迫均誘導腐胺含量增加，表明單一脅迫和復合脅迫均會導致玉米幼苗通過調節腐胺的增加來完成對幼苗的自我保護。肌醇在植物體內主要作用是合成細胞壁存儲能量[25]，試驗結果表明，在復合脅迫下，肌醇含量的升高說明玉米幼苗已經通過自我增加肌醇來對抗惡劣的生長環境。

4 結論

本試驗結果表明，2 種脅迫均導致玉米幼苗中氨基酸代謝物發生紊亂，說明機體通過調節氨基酸來對抗逆境；單一脅迫下蘋果酸含量降低而檸檬酸含量升高，說明玉米幼苗體內TCA 穩定，復合脅迫下蘋果酸和檸檬酸的含量均顯著升高，表明復合脅迫可導致玉米幼苗體內TCA 受阻；2 種脅迫均導致糖類化合物的積累，說明酸雨和鎘均會導致玉米幼苗的光合作用途徑發生紊亂；通過對腐胺、肌醇等抗逆物質的研究可知，2 種脅迫均對玉米幼苗產生了毒性，從而導致抗逆物質積累以抵抗逆境。