貓爪草酰基-Δ9脫氫酶基因植物表達載體的構(gòu)建及瞬時表達

岳 敏，宋亞楠，安 茜，趙熙寧，薛金愛，季春麗，崔紅利，李潤植

（山西農(nóng)業(yè)大學分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801）

ω-7 脂肪酸（ω-7 FA）是一類單烯脂肪酸，其雙鍵發(fā)生在脂肪酸氨基端第7 個碳（C）原子處，主要包括棕櫚油酸（C16∶1Δ9）及其碳鏈延長產(chǎn)物順式-11-十八碳烯酸（C18∶1Δ11）。這類珍稀脂肪酸在工業(yè)、食品保健、醫(yī)藥健康等方面具有獨特的功能和應(yīng)用價值[1-2]。有證據(jù)表明，ω-7 FA 在人體胰島素抵抗的病理生理學中起著關(guān)鍵作用，它會增加肌肉對胰島素的反應(yīng)[2]。棕櫚油酸具有抗氧化和抗微生物作用，在皮膚護理行業(yè)有重要應(yīng)用。此外，富含此脂肪酸的油脂制取的生物柴油具有穩(wěn)定性、可燃性及耐凍性等優(yōu)異特性[3]。但是，ω-7 脂肪酸在普通油料作物中的含量極低（＜1%）。自然界一些野生植物種子可大量富集這類脂肪酸，如貓爪草（Macfadyena unguis-cati）種子中ω-7 FAs 積累量可達79%，澳大利亞堅果（Macadamia sp.）種子中 ω-7 FAs 含量為20%～30%[4]。這些自然界富含ω-7 脂肪酸的野生植物資源由于受地理分布限制、產(chǎn)量低和農(nóng)藝性狀差等，難以滿足食品和工業(yè)對ω-7 脂肪酸的需求。因此，一些研究試圖從這些植物分離控制ω-7 FA 合成的基因，進而應(yīng)用于對普通油料作物種子油脂的遺傳修飾，以期用普通油料作物生產(chǎn)這類高附加值的ω-7 脂肪酸[5-6]。

已有研究證實，負責催化棕櫚酸（C16∶0）合成棕櫚油酸（C16∶1）的關(guān)鍵酶是酰基-Δ9 脫氫酶（acyl-Δ9 desaturase，Δ9D）[7]。普通大田油料作物 Δ9D對底物C16∶0 選擇性極低，而對C18∶0 選擇性高，這樣就導致種子油中C18∶1Δ9 含量高，而C16∶1Δ9 含量極低（通常＜1%）[1]。現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)有2 類酰基-Δ9 脫氫酶，即在質(zhì)體內(nèi)行使功能的酰基-ACP-Δ9脫氫酶（ACP-Δ9D）和在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上工作的酰基-CoA-Δ9 脫氫酶（CoA-Δ9D）。CAHOON 等[8-9]研究發(fā)現(xiàn)，從馬利筋（Asclepias syriaca）發(fā)育種子中分離到的ACP-Δ9 脫氫酶基因克隆，其編碼產(chǎn)物對C18∶0-ACP 底物的特異性是C16∶0-ACP 底物特異性的13 倍；而來源于貓爪草發(fā)育種子的ACP-Δ9 脫氫酶對C16∶0-ACP 底物特異性是C18∶0-ACP底物特異性的5 倍。顯然，不同植物來源的酰基-Δ9脫氫酶底物特異性差別較大，需進一步深入解析酰基-Δ9 脫氫酶底物特異性機制以及其在植物油脂遺傳改良上的應(yīng)用價值[10]。

山西農(nóng)業(yè)大學分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所前期已從富含ω-7 脂肪酸的野生植物貓爪草發(fā)育種子中分離到編碼質(zhì)體型酰基-ACP-Δ9 脫氫酶的cDNA 克隆（MucACP-Δ9D）。本研究構(gòu)建了該基因的植物組成型表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導滲透侵染法在本氏煙草（Nicotiana benthamiana）葉組織中瞬時表達，以期評價MucACP-Δ9D 能否應(yīng)用于異源植物組織油脂代謝途徑的遺傳修飾，進而提高受體植物ω-7 脂肪酸的合成和積累。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

本氏煙草種子由山西農(nóng)業(yè)大學分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所提供。將其播種于25 ℃，12 h/d 的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60～80 d，用于煙草瞬時表達。農(nóng)桿菌 EHA105，pCAMBIA1303，大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)，目的基因克隆MucACP-Δ9D 均由山西農(nóng)業(yè)大學分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所保存。

所用試劑包括限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SmaⅠ，瓊脂糖凝膠回收試劑盒，小量質(zhì)粒提取試劑盒，Trizol Reagent，PCR引物，DNA Ladder Marker，Premix Taq Version 2.0 和DNAiso Reagent 等均購于上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 貓爪草MucACP-Δ9D 植物表達載體的構(gòu)建設(shè)計含有酶切位點XbaⅠ和SmaⅠ的特異性引物，利用高保真PCR 試劑盒擴增克隆載體（PMD18-T）上的MucACP-Δ9D 基因。PCR 產(chǎn)物電泳分離后，割膠回收并純化。利用T4DNA 連接酶將MucACP-Δ9D與XbaⅠ和 SmaⅠ酶切后的pCAMBIA1303 進行連接，溫度16 ℃，連接16 h。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 中，篩選陽性克隆提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證。用于PCR 擴增MucACP-Δ9D、含有酶切位點XbaⅠ和 SmaⅠ的特異性引物為 F1：5′-CTCTAGAATGGCCTTGAAGCTGAAT-3′和 R1:5′-CCCCGGGTCAGAGTTGCACCTCTCT-3′（下劃線分別為XbaⅠ和SmaⅠ酶切位點序列）。

構(gòu)建 MucACP-Δ9D 基因 pCAMBIA1303 植物組成型表達載體簡示如圖1所示。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導的煙草瞬時表達分析 將構(gòu)建好的MucACP-Δ9D-pCAMBIA1303 植物組成型表達載體和空載pCAMBIA1303，利用熱激法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105 中。過夜搖菌至OD600為0.6 左右離心，用配制好的農(nóng)桿菌緩沖液重懸至菌體濃度OD600為0.2，室溫放置4 h后用滲透法侵染7 葉期煙草植株的葉片。煙草植株室溫生長至3，5 d，分別取煙葉樣品，且取未侵染的和空載體侵染的煙葉作為對照。

1.2.3 煙草葉片的RNA 提取和RT-PCR 檢測 取侵染3 d 后的煙草葉片和對照煙葉，利用Trizol 法提取總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA[11]。以 cDNA 為模板，進行 RT-PCR 檢測目標基因是否表達。

1.2.4 煙草葉片的脂肪酸提取 取侵染5 d 的煙草葉片與對照葉片，冷凍干燥后，提取脂肪酸，用氣相色譜儀（GC）測定脂肪酸成分及含量，具體方法參照文獻[12]進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 貓爪草MucACP-Δ9D植物表達載體的鑒定

利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和 SmaⅠ對構(gòu)建好的植物表達性載體質(zhì)粒進行酶切驗證，結(jié)果如圖2所示，較亮的一條帶為載體pCAMBIA1303 的條帶，較弱的一條帶為目的基因MucACP-Δ9D 的條帶，長度為1 191 bp，與該基因ORF 完全一致。表明載體構(gòu)建成功，可以用于后續(xù)的轉(zhuǎn)化。

2.2 陽性農(nóng)桿菌菌落PCR鑒定

將重組質(zhì)粒利用熱激法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105 中，從圖3可以看出，菌液PCR 獲得一條1 191 bp 的產(chǎn)物 即目的基因MucACP-Δ9D 條帶。表明MucACP-Δ9D 植物表達載體成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，可用于后續(xù)侵染煙草。

2.3 MucACP-Δ9D在煙葉組織中瞬時表達的鑒定

取侵染3 d 后的煙草葉片，提取RNA（圖4），并且反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以MucACP-Δ9D 序列引物進行RT-PCR 擴增，結(jié)果如圖5所示，目的基因MucACP-Δ9D 在煙草葉組織中成功表達。

2.4 MucACP-Δ9D瞬時表達煙葉脂肪酸成分分析

表1 MucACP-Δ9D 瞬時表達的煙葉脂肪酸成分及含量 %

為檢測MucACP-Δ9D 在煙葉組織中是否具有酶活性，催化合成棕櫚油酸（C16∶1Δ9），試驗中取侵染5 d 的煙葉，提取脂肪酸，用氣相色譜儀測定脂肪酸成分及含量（表1）。從表1可以看出，棕櫚酸C16∶0 的含量顯著下降，由對照的24%平均減少至18.7%；棕櫚油酸C16∶1Δ9 的含量及其延伸產(chǎn)物C18∶1Δ11 由對照組較低的含量（≤0.4%）增加到7.5%～9.8%和4.3%～6.2%，總ω-7 脂肪酸的含量平均提高到14.2%。亞油酸（C18∶2）的含量由對照的22.6%平均下降至19.0%，亞麻酸（C18∶3）含量由對照的27.2%平均下降至22.0%，而飽和脂肪酸（C18∶0）和油酸（C18∶1Δ9）的含量變化均不明顯。

3 討論

由于ω-7 脂肪酸是一類健康有益型脂肪酸，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和提高人體免疫功能方面具有重要作用[13]。同時，這類脂肪酸也是生產(chǎn)工業(yè)化學品辛烯的優(yōu)質(zhì)原料。如何生產(chǎn)更多的ω-7 脂肪酸以滿足日益增長的市場需求，是一個亟待解決的問題[14]。在普通油料作物中，對酰基-Δ9 脫氫酶進行遺傳操作是一條可行途徑，已有一些研究表明，該方法具有良好的可行性[15-16]。例如，ETTAKI 等[17]將催化 ω-7脂肪酸生物合成的棕櫚酰基-ACP-Δ9 脫氫酶（PADs）在模式植物擬南芥中表達，獲得種子ω-7 脂肪酸含量從占總脂肪酸的10%到大于50%，且種子萌發(fā)正常。NGUYEN 等[18]通過對亞麻薺種子參與油脂代謝多個基因整合調(diào)控，顯著提高了ω-7 脂肪酸合成積累，其含量為總脂肪酸的60%～65%。生物信息學分析顯示，多種不同植物來源的酰基-ACP-Δ9 脫氫酶具有高度序列相似性。然而，這些酰基-ACP-Δ9 脫氫酶催化合成的產(chǎn)物不同，這些產(chǎn)物包括 C18∶1Δ9，16∶1Δ9，16∶1Δ4 和 14∶1Δ9等。可見，應(yīng)用這些酶基因于植物油脂遺傳修飾時，其前提是解析它們的酶活性以及底物特異性[19]。

本研究從富含ω-7 脂肪酸的野生資源植物貓爪草中分離到的編碼Acyl-ACP-Δ9D 的cDNA 克隆（MucACP-Δ9D），成功構(gòu)建了該基因的植物表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導的滲透侵染法使其在本氏煙草葉組織中瞬時表達。生理生化測試表明，MucACP-Δ9D 瞬時表達的煙葉組織中ω-7 脂肪酸（棕櫚油酸和其延伸產(chǎn)物順式-11-十八碳烯酸）含量顯著提高，相應(yīng)地，棕櫚酸含量減低。這預(yù)示著MucACP-Δ9D 在異源煙葉中具有催化棕櫚酸生成棕櫚油酸的酶活性。另外，在該基因表達的煙葉組織中，亞油酸（C18∶2）和亞麻酸（C18∶3）含量也降低。這可能是由于宿主本身作為單烯酸含量增加的一種次級補償反應(yīng)，其機制還有待深入研究。

4 結(jié)論

本研究表明，來源于富含ω-7 脂肪酸的貓爪草的MucACP-Δ9D 具有催化棕櫚油酸合成的酶活性，可以異源表達用于對其他油脂植物的脂肪酸合成途徑的遺傳修飾，以生產(chǎn)高附加值的ω-7 脂肪酸。