劃胚方法對玉米單倍體加倍效率的影響

張培風，王長彪，趙興華，劉 江，韓 斌，路貴和

（1.山西大學生物工程學院，山西 太原 030006；2.山西省農業科學院生物技術研究中心，山西 太原 030031）

玉米作為世界上重要的農作物之一，具有高產、穩產的特點[1]。隨著工業和農業的快速發展，我國對玉米的需求量大幅增加[2]。玉米作為雜種優勢效果最顯著的作物，其主要的核心環節是如何快速獲得優良的自交系[3]。目前，在育種領域快速選育自交系主要采用單倍體育種技術，只需1～2 個世代即可獲得性狀優良的純系，而常規育種則需6～7 代，利用單倍體育種技術的優勢，能夠極大地提高育種效率[4]。玉米單倍體的倍增主要是通過自然加倍和化學加倍，但自然加倍率較低。據報道，最高的自然加倍率也僅有5%[5]，達不到加倍的理想狀態，因此，大多數研究者主要采用化學加倍方法，利用秋水仙素加倍試劑可以大大提高加倍效率。研究表明，不同的秋水仙素處理濃度、處理時間和處理部位，加倍效率大不相同[6-7]。但在加倍過程中往往會出現秋水仙素毒性污染、實驗操作流程復雜、成本較高、受客觀條件限制等問題，因此，急需探索一種低毒高效、操作簡便、加倍效率高的加倍方法。

目前，育種界玉米單倍體加倍方法主要采用浸種法、浸根法、切芽法、注射法及組培法等。GAYEN等[8]采用浸種法，對單倍體種子用不同質量分數的秋水仙素進行不同時間的浸泡處理，結果表明，單倍體種子在0.06%的秋水仙素中浸泡12 h 加倍效果最佳，加倍成功的種子占18%。文科等[9]采用浸根法，當玉米種子發芽到5～7 cm 時，將其幼根浸泡至秋水仙素溶液中，結果表明，0.02%的秋水仙素為最佳。劉海等[10]通過對處于芽苗期內玉米單倍體噴施秋水仙素，不同濃度處理下散粉率最高的可達42.5%。CHASE[11]于1952年采用0.05%的秋水仙素溶液對玉米單倍體盾片節進行注射，研究表明，經處理的單倍體結實率是對照組的4 倍多。陳寶健等[12]通過幼胚組培的方法研究表明，不同濃度甲酰胺草磷處理的單倍體雄穗散粉效果存在明顯差異，其中，1 μmol/L 處理 72 h 的成株散粉率可達37.0%。

本試驗結合前人浸種法的研究，通過對玉米單倍體胚部劃胚的方法，用不同質量分數的秋水仙素和不同處理時間進行加倍處理，對玉米單倍體的加倍效率進行研究，以期開辟一條高效率、操作簡便的單倍體加倍的新技術途徑，從而為單倍體育種提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為以玉米自交系TX3-2 和DK516 組配的雜交種為母本、誘導系TY1 為父本進行誘導后挑選出的單倍體種子。加倍試劑為二甲基亞砜和秋水仙素，均來自于Solarbio 試劑公司，其中，秋水仙素純度為98%。所有材料均種植于山西省農業科學院位于海南省的南繁試驗基地和山西省農業科學院東陽試驗基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子的劃胚處理 將篩選出的單倍體種子用流水沖洗干凈，放置于滅菌培養皿中，用清水浸泡，置于28 ℃培養箱內，24 h 后將處于萌動狀態的玉米籽粒取出，用濾紙濾干水分，使用消毒后的刀片在種子胚芽部表層輕劃2～3 mm。全程操作需戴一次性消毒手套及口罩。

1.2.2 秋水仙素處理 將劃胚后的單倍體種子和對照組（經24 h 清水浸泡后未劃胚的單倍體種子）分別放置在質量分數為0，0.04%，0.06%，0.08%，0.12%的秋水仙素溶液中，分別處理3，6 h。

1.2.3 處理后的清洗 將秋水仙素處理后的單倍體進行流水清洗1～2 h，瀝干后移至試驗田。

1.2.4 田間觀察及記錄 將處理過的單倍體種子單粒播種于田間，觀察并記錄各處理的出苗率、成活率、散粉率和結實率。以單倍體加倍后的散粉情況來判斷玉米單倍體是否加倍。

1.3 數據處理

試驗數據采用SPSS 軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 劃胚處理對玉米單倍體加倍效率的影響

從表1可以看出，劃胚處理下玉米單倍體加倍后植株的出苗率和成活率受到影響，其平均值均低于不劃胚處理的植株；但植株的散粉率和結實率均顯著增加，其散粉率和結實率平均分別為19.17%，9.17%，明顯高于不劃胚加倍處理（5.63%，2.09%）。

表1 劃胚處理對玉米單倍體加倍效率的影響

從表2，3，4，5可以看出，劃胚處理對玉米單倍體加倍后植株的出苗率、散粉率、結實率的影響與不劃胚處理間差異均達顯著水平（P＜0.05），對成活率的影響差異達極顯著水平（P＜0.01）。可見，玉米單倍體胚部劃胚處理能夠顯著地提高玉米單倍體的散粉率和結實率。

表2 劃胚處理對玉米單倍體加倍后出苗率的方差分析

表3 劃胚處理對玉米單倍體加倍后成活率的方差分析

表4 劃胚處理對玉米單倍體加倍后散粉率的方差分析

表5 劃胚處理對玉米單倍體加倍后結實率的方差分析

2.2 不同質量分數的秋水仙素對劃胚后玉米單倍體加倍效果的影響

從表6可以看出，在劃胚和不同質量分數秋水仙素加倍條件下，玉米單倍體加倍后植株的出苗率、成活率、散粉率和結實率均有不同程度的提高（0.08%秋水仙素處理除外），其中，0.04%秋水仙素處理的植株出苗率、成活率、散粉率和結實率均最高，分別為44.17%，36.67%，17.09%和9.59%；隨著秋水仙素質量分數的不斷增加，玉米植株的出苗率、成活率、散粉率和結實率都有下降趨勢。由此說明，秋水仙素質量分數越高，對植株的生長影響越大，在秋水仙素質量分數為0.04%的加倍處理條件下，對玉米單倍體加倍后的植株傷害最小，加倍效果較明顯。

2.3 秋水仙素不同處理時間對劃胚后玉米單倍體加倍效果的影響

玉米單倍體加倍后植株的散粉率可以用來判斷單倍體加倍效果，其散粉率越高，代表加倍效果越好。由圖1可知，玉米單倍體加倍后的植株散粉率隨著秋水仙素質量分數的增高而降低，當加倍處理在同一秋水仙素質量分數下，加倍3 h 植株的散粉率高于加倍6 h 的植株散粉率，其中，秋水仙素質量分數為0.04%、加倍時間為3 h 時植株散粉率最高，可達17.09%。由此可得，選擇合適質量分數的秋水仙素和處理時間能夠通過劃胚后植株的散粉率表現出最佳的加倍效果，其中，當秋水仙素質量分數為0.04%、加倍時間為3 h 時植株的散粉率最高，加倍效果最好。

3 結論與討論

秋水仙素可以有效提高單倍體的加倍效率，早在1955年，SEANEY[13]采用浸泡法用秋水仙素對玉米單倍體的幼苗根部進行處理，結果發現，只有2株植株散粉，加倍效果較差。GAYEN 等[14]研究表明，用0.05%秋水仙素對玉米單倍體根部浸泡24 h，單倍體材料加倍效果最好。劉志增等[15]采用注射法分別對處于6 葉期和拔節期的玉米單倍體進行注射，結果表明，秋水仙素為0.05%和0.01%的玉米單倍體散粉率較高，加倍效果較好。劉俊等[16]用0.06%的秋水仙素溶液和2%的DMSO 分別采用浸根法、滴注心葉和針刺生長點法對單倍體進行處理，結果表明，加倍效果最好的是針刺生長點法，平均加倍率可以達到23%。惠國強等[17]采用不同質量分數的除草劑對6 葉期幼苗滴心法處理，結果表明，利用80 μmol/L的甲基胺草磷處理加倍效果最佳，平均加倍率可達23.32%。范志青[18]用0.06%的秋水仙素溶液對玉米幼胚處理24 h，加倍效率最高。謝琦[19]采用組培技術對玉米單倍體幼胚進行加倍，結果發現，在光照為2 000 lx，溫度在26 ℃時幼胚快速顯色；當秋水仙素為0.04%、處理24 h 時加倍效果最好。李浩川等[20]采用不同質量分數的秋水仙素對玉米單倍體成熟胚進行加倍處理，結果表明，用0.005%質量分數的秋水仙素處理24 h 加倍效果最佳，綜合效率可達57.61%。杜文平等[21]對玉米單倍體幼芽切根進行處理，其中取根長5～10 mm，秋水仙素為0.06%和0.2%的二甲基亞楓處理加倍效果最佳，散粉率和結實率分別達51.39%和8.74%。本試驗通過對玉米成熟籽粒劃胚進行加倍處理，與前人通過浸泡、滴心、針刺及幼苗成熟胚組培方法相比較，可以簡便流程，不受人員和時間限制，并得到了理想的加倍效果。在利用秋水仙素加倍過程中，要做好防毒工作，秋水仙素是白色或黃色粉末，無味，屬劇毒物質，3～13 mg 就會導致人體窒息死亡[22]，因此，在實驗完畢后應做好秋水仙素廢液處理，從而降低秋水仙素對人體和環境的污染。

本研究中，通過對玉米單倍體成熟籽粒胚部劃胚，并結合不同質量分數的秋水仙素及不同處理時間對玉米單倍體進行加倍，結果表明，玉米單倍體胚部劃胚處理顯著高于自然加倍；當秋水仙素質量分數為0.04%、處理3 h 時，秋水仙素對植株的傷害最小，散粉率最高，達17.09%，加倍效果最好。這可能是因為籽粒胚部生長點處于分生組織區，細胞分裂快，當受到輕微損傷后在秋水仙素處理下，刺激更加明顯，導致加倍效率增加。本研究為單倍體加倍開辟了一條新的技術途徑，通過不斷地完善能夠為玉米雙單倍體工程化和規模化提供技術基礎。