紫蘇PfPDCT基因序列特征及表達分析

任文燕，周雅莉，楊慧娟，郝月茹，楊宏斌，李潤植，王計平

（1.山西農業大學農學院，山西 太谷 030801；2.山西農業大學分子農業與生物能源研究所，山西 太谷 030801）

紫蘇（Perilla frutescens L.Britt），又名赤蘇、香蘇、白蘇、桂蘇等，屬唇形科紫蘇屬1年生草本植物[1-2]。紫蘇資源豐富，遍布我國河北、山西、湖南、廣西、海南等20 多個省份，具有特異芳香，是衛生部第一批規定的既是食品又是藥品的60 種作物之一[3-4]，在食品醫藥領域具有重要的開發利用價值，近年來備受人們關注。紫蘇種子含油量高達45%，其中，α-亞麻酸（18∶3）含量在種子中占總脂肪酸含量的60%以上，在葉片中占56%[5]。目前，紫蘇作為一種新型油料作物被人們廣泛接受[6]。

脂肪酸是生物體的基本組成之一，對人體具有重要的生理功能，其中，亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸可以促進人體消化吸收、軟化血管、防止形成血栓等[7]。BROUN 等[8]和 DAWN 等[9]研究表明，適量攝入不飽和脂肪酸能夠降低人體內膽固醇與血脂水平。磷脂酰膽堿甘油二脂轉磷酸膽堿酶（PDCT）可以調節不飽和脂肪酸的最終含量，影響種子油中脂肪酸的組成[10]。LU 等[11]研究結果表明，擬南芥中PDCT 基因突變（rod1）能夠降低其多不飽和脂肪酸的積累。PDCT 基因在多種植物中的功能已有報道[12-13]，但關于該基因是否參與紫蘇種子油中脂肪酸的合成積累過程，目前尚未見報道。

本試驗利用生物信息學軟件對紫蘇PfPDCT 基因結構及編碼蛋白的理化性質進行了詳細分析，并研究了該基因在晉紫蘇1 號種子發育不同時期的表達特性，旨在為今后利用PfPDCT 基因改良油料作物品質及分子育種提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試紫蘇品種為晉紫蘇1 號，2018年4月種植于山西農業大學試驗基地，在紫蘇種子不同發育時期（即開花后 10，20，30，40 d）分別取樣，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存備用。

從紫蘇油脂代謝機制研究課題組前期測序獲得的紫蘇轉錄組數據庫中挑選出功能注釋為PDCT的基因，根據不同物種間同源基因的核酸序列相對保守的特點，將紫蘇中PDCT 基因序列和擬南芥中的同源序列進行比對，獲得紫蘇PfPDCT 基因全長cDNA 序列。

1.2 試驗方法

1.2.1 PDCT 基因結構及理化性質分析 運用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）軟件分析紫蘇PfPDCT 基因的開放閱讀框（ORF）；利用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）軟件，根據ORF 分析所得的紫蘇PfPDCT 基因的氨基酸序列，進一步分析該基因編碼蛋白的基本理化性質；運用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）軟件分析紫蘇PfPDCT 蛋白跨膜區域；運用NCBI 的 CDD 工具（http://ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/Wrpsb.cgi）預測紫蘇PfPDCT 蛋白質功能結構域；采用 SPOMA（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl）分析紫蘇PfPDCT 蛋白質的二級結構；運用SWISS-Model 工具預測紫蘇PfPDCT 蛋白質的三級結構；使用MEGA7 多序列比對軟件構建紫蘇PfPDCT 基因編碼蛋白的系統進化樹。

1.2.2 實時熒光定量PCR 采用EASY spin Plus多糖多酚/復雜植物RNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取紫蘇RNA，反轉錄參考 ABM 公司 5X All-In-One MasterMix（with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）反轉錄成 cDNA。使用Premier 5.0 軟件設計紫蘇PfPDCT 的qRT-PCR特異引物（表1），參照張玲慧[14]對紫蘇內參基因的篩選結果，選擇18S rRNA 作為本試驗的內參基因，以獲得的cDNA 為模板進行實時熒光定量PCR 檢測。應用CFX96 Real-Time PCR Detection System 進行擴增，反應體系為：SYBR PremixExTaqⅡ5 μL，PCR Forward Primer 0.3 μL，PCR Reverse Primer 0.3 μL，DNA 模板 0.5 μL，ddH2O 3.9 μL，共 10 μL，3 次重復。反應程序為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共 40 個循環。相對表達量采用 2-ΔΔCt法進行計算[14]。

表1 引物序列

2 結果與分析

2.1 PfPDCT基因序列結構及編碼蛋白的理化性質

通過對轉錄組測序結果進行比對分析，獲得紫蘇PfPDCT 基因核酸序列長度共2 098 bp，開放閱讀框長度為1 683 bp，共編碼560 個氨基酸殘基。利用ProtParam 軟件對紫蘇PfPDCT 基因編碼蛋白的理化性質進行分析，其化學分子式為C2782H4299N675O715S21，原子總數為8 492，相對分子質量為59.315 ku，正負電荷殘基數分別為30，15 個。脂溶指數為112.43，親水性系數為0.727，不穩定系數為35.00，推測其為穩定蛋白。

運用TMHMM 軟件預測紫蘇PfPDCT 蛋白的跨膜結構域，結果表明，第1～12 位氨基酸位于細胞膜內側，第36～2 098 位氨基酸位于細胞膜外側，第13～35 位氨基酸為紫蘇PfPDCT 蛋白的跨膜區域（圖1）。通過分析紫蘇PfPDCT 蛋白質的功能結構域，發現該基因所編碼的蛋白質屬于CitT superfamily 超家族中的成員。

運用SPOMA 軟件分析紫蘇PfPDCT 蛋白的二級結構，其中，α- 螺旋占41.25%，延伸鏈占20.18%，β-轉角占7.50%，無規則卷曲占31.07%。由此推測，α 螺旋和無規則卷曲是PfPDCT 蛋白二級結構中的主要結構元件，延伸鏈和β-轉角則分散于整個蛋白質中。運用SWISS-Model 軟件預測出紫蘇PfPDCT 蛋白質的三級結構（圖2），由α-螺旋、β 轉角、延伸鏈、無規則卷曲組成，與二級結構預測一致。

在NCBI 上利用BLAST 與其他物種的PDCT基因核苷酸序列進行比對，并利用MEGA7 軟件構建紫蘇與其他幾種植物PDCT 基因的系統發育樹，結果表明，紫蘇與赤蘚的親緣關系最近（圖3）。

2.2 PfPDCT基因表達特性分析

通過實時熒光定量PCR 分析，結果表明，紫蘇PfPDCT 基因在不同發育時期的種子中均有表達，其中，在開花后20 d 表達量最高，為開花后10 d 的1.92 倍，該基因高量表達之后進入脂肪酸快速積累期，說明PfPDCT 基因在紫蘇種子脂肪酸代謝積累過程發揮了一定作用（圖4）。

3 結論與討論

磷脂酰膽堿甘油二脂轉磷酸膽堿酶（PDCT）是影響脂肪酸合成的重要酶，對植物油脂代謝具有一定的調控作用。已有研究表明，PDCT 在發育種子油脂合成過程中主要催化16∶1-PC 與16∶1-DAG的相互轉化[15-17]。WICKRAMARATHNA 等[12]將亞麻中克隆到的PDCT 基因轉入擬南芥rod1 突變體，可以恢復突變體植株的多不飽和脂肪酸水平。王樹彥等[10]研究表明，在胡麻種子成熟期，PDCT 基因表達量與種子油中硬脂酸及亞麻酸含量呈顯著正相關，而與亞油酸含量呈顯著負相關。HU 等[18]研究表明，PDCT 基因是轉基因擬南芥種子中羥化脂肪酸（HFA）有效代謝所必需的。研究表明，PDCT 參與油料作物種子中脂肪酸的合成與代謝過程。

紫蘇作為一種新型油料作物，目前，關于其種子油脂代謝機制的研究越來越引起人們的關注。本研究分析了紫蘇PfPDCT 基因的結構和功能，并通過qRT-PCR 技術分析了該基因在晉紫蘇1 號種子發育不同時期的表達特性，結果表明，紫蘇PfPDCT基因全長cDNA 序列為2 098 bp，開放閱讀框為1 683 bp，共編碼560 個氨基酸殘基；該基因所編碼的蛋白質屬于CitT superfamily 超家族中的成員；系統進化分析表明，紫蘇與赤蘚的親緣關系最近；紫蘇PfPDCT 基因在不同發育時期的種子中均有表達，且在開花后20 d 表達量最高，為開花后10 d 的1.92 倍；PfPDCT 基因的表達模式與種子發育過程中TAG 積累模式一致，在種子發育中期TAG 快速合成并積累，在種子發育后期TAG 逐漸趨于飽和，合成量降低[19]，進一步證明紫蘇PfPDCT 基因參與種子油脂合成積累過程，該研究可為進一步探索紫蘇等油料作物的脂肪酸合成代謝機制奠定理論基礎。